假單胞菌中Red-ET重組系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、假單胞菌屬（Pseudomonas）是假單胞菌科的一屬，屬于γ-變形菌綱，是分布最廣的微生物之一。假單胞菌生存環(huán)境的多樣性造就了假單胞菌多種多樣的營養(yǎng)代謝類型，同時也為提供了豐富的遺傳資源。隨著基因組工程的發(fā)展，完成全基因組測序的假單胞菌種類越來越多，預(yù)測的次級代謝產(chǎn)物種類比較豐富，其中惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginoda），熒光假單胞菌(Pseudomonas

2、fluorescens)和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)是常見的幾種假單胞菌，惡臭假單胞菌可以降解有機污染物，對環(huán)境進行生物修復(fù)，改造與有機污染物降解相關(guān)的基因是構(gòu)建降解工程菌的基礎(chǔ);熒光假單胞菌是植物促生菌，可以在植物根部定植，產(chǎn)生對植物病原菌有拮抗作用的次生代謝產(chǎn)物;丁香假單胞菌是植物致病菌，染色體上的毒力島基因簇中有致病因子的合成基因，通過對致病基因的改造可以更深入研究其致病機制;銅綠假單胞菌是人類的條件

3、致病菌，其抗感染治療面臨嚴(yán)重的耐藥性問題。減毒活疫苗是一種有效的銅綠假單胞菌感染治療方法，減毒的銅綠假單胞菌需要通過基因工程方法改造獲得。但是假單胞菌的幾種模式菌株中還沒有有效的遺傳操作方法，本課題在Red/ET同源重組技術(shù)的基礎(chǔ)上，根據(jù)假單胞菌自身噬菌體的重組蛋白構(gòu)建一套新型高效簡捷的遺傳操作體系，并利用新型的遺傳操作體系對假單胞菌基因組進行遺傳修飾改造。
　　以Red/ET同源重組技術(shù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建一系列遺傳操作系統(tǒng)。在假單胞菌

4、和其噬菌體基因組中尋找大腸桿菌噬菌體λRed操縱子或者大腸桿菌Rac前噬菌體RecET操縱子類似的同源蛋白，BLAST顯示銅綠假單胞菌噬菌體vB_ PaeP_Tr60_Ab31中有與λRed類似的操縱子（Orf38，Orf37和Orf36），來自丁香假單胞菌B728a原噬菌體(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)中有與RecET類似的操縱子(RecTEpsy)，分析顯示Orf38類似于單鏈退火蛋

5、白Redβ，Orf37類似于5'-3'的核酸外切酶Redα，Orf36類似于大腸桿菌DNA單鏈結(jié)合蛋白(SSB)，以這兩個操縱子為基礎(chǔ)構(gòu)建一系列的遺傳操作系統(tǒng)。
　　比較選擇不同假單胞菌中最佳的遺傳操作系統(tǒng)，利用最佳的遺傳操作系統(tǒng)在不同假單胞菌中進行基因修飾。將構(gòu)建的一系列遺傳操作系統(tǒng)轉(zhuǎn)入常見的假單胞菌惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和丁香假單胞菌，比較這些遺傳操作系統(tǒng)在不同假單胞菌的重組效率，確定不同菌最佳的遺傳操作系統(tǒng)

6、。功能檢測結(jié)果表明，λRed類似的操縱子和RecET類似的操縱子與Redγ/Pluγ組成的雜合遺傳操作系統(tǒng)能夠在假單胞菌中工作，并且SSB蛋白可以顯著的提高重組效率。通過比較與鑒定，分別挑選到了不同假單胞菌的最佳重組系統(tǒng)，成功對假單胞菌進行基因組的修飾，并與反向篩選標(biāo)記共同作用對基因組進行無痕修飾，包括插入啟動子和突變致病基因。
　　在假單胞菌中建立和優(yōu)化新型遺傳操作系統(tǒng)，可方便、快捷地對假單胞菌進行遺傳操作，構(gòu)建的系統(tǒng)包括DNA

7、雙鏈核酸外切酶，DNA單鏈退火蛋白、宿主核酸外切酶抑制蛋白和宿主的單鏈結(jié)合蛋白。反應(yīng)底物雙鏈DNA可以通過一步PCR獲得，進行遺傳操作時一步重組得到需要的重組子，周期短效果明顯，促進了假單胞菌和其他相關(guān)菌株的功能基因組學(xué)研究。
　　銅綠假單胞菌噬菌體中的SSB蛋白能有效提高假單胞菌和大腸桿菌的重組效率。在研究假單胞菌的遺傳操作系統(tǒng)時，發(fā)現(xiàn)來自于銅綠假單胞菌噬菌體的SSB蛋白在遺傳操作系統(tǒng)中有比較重要的作用，在銅綠假單胞菌和大腸桿菌

8、中，噬菌體vB PaeP_Tr60_Ab31的SSB蛋白與Redγ蛋白共表達可以提高遺傳操作系統(tǒng)的重組效率。但是在本課題研究中SSB蛋白沒有消除DNA雙鏈二級結(jié)構(gòu)的作用，還需要更進一步的研究來揭示SSB蛋白提高重組效率的機理。
　　本課題是針對假單胞菌建立一系列新型、高效的遺傳修飾系統(tǒng)。利用新型重組系統(tǒng)在假單胞菌中成功進行了一系列遺傳修飾，包括進行點突變和與反向篩選標(biāo)記結(jié)合的無痕修飾等。本課題構(gòu)建的新型重組系統(tǒng)可以促進假單胞菌和其