1、本課題主要是運用real-time PCR絕對定量和16SrDNA PCR-DGGE指紋圖譜數(shù)字化的方法建立南美白對蝦中微生物(單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌、假單胞菌和巨型球菌)的預測模型。
首先,在4℃和10℃溫度條件下,建立單增李斯特氏菌和副溶血性弧菌在南美白對蝦上的預測模型。本實驗同時采用了傳統(tǒng)的涂布計數(shù)法、real-time PCR定量檢測方法和DGGE方法,并將傳統(tǒng)方法和這兩種分子方法所建立的預測進行比
2、較,分析分子生態(tài)學建立微生物模型的可行性及可靠性。
用統(tǒng)計學方法對單增李斯特氏菌相關系數(shù)(R2)、最大比生長速率(μmax)、延滯期(?)、最大細胞濃度(A)進行顯著性分析,較傳統(tǒng)涂布方法與real-time PCR方法所得參數(shù)均無顯著性差異(P>0.05)。用real-time PCR方法建立副溶血性弧菌預測模型,通過分析主要是因為副溶血性弧菌在低溫是呈遞減趨勢,而在低溫條件下副溶血性弧菌會進入活的不可培養(yǎng)狀態(tài)(VBNC狀態(tài)
3、),該狀態(tài)的細菌無法通過傳統(tǒng)涂布計數(shù)方法計數(shù),然而用real-time PCR方法通過DNA的提取就可以對DNA進行定量,從而得到細菌數(shù)量。所以real-time PCR定量方法可以用于建立微生物預測模型。
DGGE方法所得數(shù)據(jù)對單增李斯特氏菌的擬合結果與傳統(tǒng)方法相似度和很高,而描述4℃和10℃時副溶血性弧菌的數(shù)量變化趨勢存在一定偏差。4℃時,傳統(tǒng)方法和DGGE方法描述的副溶血性生長趨勢是相同的,而10℃時,這兩種方法所得的模
4、型趨勢不同,這一現(xiàn)象需進一步研究。由于本文是首次提出并運用DGGE方法建立微生物預測,該方法處于起步階段,存在一定的缺陷,但是由于DGGE一次可以觀察多種菌,可以明顯看出微生物生長的趨勢,在預測微生物領域還是很有發(fā)展的潛力。
其次,通過上一章的實驗結果,得出用分子生態(tài)學建立微生物預測模型的可行性。所以,在4℃和10℃溫度條件下,用分子生態(tài)學建立五株菌(單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、腸炎沙門氏菌、假單胞菌和巨型球菌)在南美白對蝦
5、上的生長的預測模型。
real-time PCR定量數(shù)據(jù)模型擬合結果:4℃和10℃這兩個溫度下,不同模型對單增李斯特氏菌的擬合相關系數(shù)R2均在0.9以上。4℃和10℃時,只有Baranyi模型適合用于腸炎沙門氏菌和巨型球菌生長的擬合。相同的數(shù)據(jù)不同的模型擬合效果不同,所以需要對不同模型進行選擇
同樣,對數(shù)字化的DGGE圖譜進行模型的擬合,同樣得出4℃和10℃這兩個溫度下該方法對單增李斯特氏菌的擬合相關系數(shù)R2均在0.
6、9以上,對于假單胞菌的擬合相關系數(shù)有0.8以上,而對于其他3株菌的擬合相關系數(shù)R2低于0.7。副溶血弧菌在4℃條件是致死的一種情況,μmax是負值,而且只有Baranyi模型對單增李斯特氏菌和腸炎沙門氏菌擬合所得的延滯期是非負數(shù),所以Baranyi模型適合用于以上兩株菌的擬合。從模型擬合結果顯示,DGGE方法能很好的呈現(xiàn)微生物的生長趨勢。
本文首次運用DGGE方法對圖譜數(shù)字化并建立微生物預測模型;首次運用real-time P
7、CR定量方法和DGGE方法所得數(shù)據(jù)同時建立了多株菌的預測模型。由于分子生物學快速、靈敏、特異性好等優(yōu)點,real-time PCR方法已被用于微生物定量檢測。對于一些實驗室不能培養(yǎng)的微生物卻能用分子生物學方法定量,而且傳統(tǒng)的微生物計數(shù)方法通過一種選擇性培養(yǎng)基只能檢測一種微生物,而且在背景微生物復雜的情況下選擇性培養(yǎng)基的特異性就會收到干擾,所以分子生物學方法不但同時可以檢測多種微生物而且特異性好。運用分子生物學定量方法來建立微生物預測模型
8、,在國內外都是一個很新的概念?？紤]到樣品DNA提取、PCR操作、模型選擇等問題運用分子生態(tài)學建模還需要很多人進一步的優(yōu)化條件,選擇更合適的模型。而DGGE方法雖然不能很準確的反應微生物的數(shù)量,但是從條帶的峰值可以間接的反應微生物的量。但是,運用于建立微生物預測模型還屬首創(chuàng),從本實驗結果可以得出,用DGGE圖譜數(shù)字化方法建立微生物預測模型可以得出微生物的生長趨勢。但是,運用分子生態(tài)學方法建模還處于起步階段,但是由于該方法的一些優(yōu)越性,運用
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