鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶原核基因工程菌的構(gòu)建與表達條件優(yōu)化.pdf

1、新橙皮苷在植物內(nèi)的含量較低，其同分異構(gòu)體橙皮苷在植物體內(nèi)含量較高。兩者的結(jié)構(gòu)上的差異僅僅是黃酮環(huán)上取代基上葡萄糖與鼠李糖的糖苷鍵不同。本研究希望利用生物轉(zhuǎn)化法將橙皮苷轉(zhuǎn)化為新橙皮苷。本文通過構(gòu)建一株原核工程菌來表達鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶，該酶可以催化鼠李糖與葡萄糖通過1,2糖苷鍵連接，以此來合成新橙皮苷，并且對其酶學性質(zhì)進行研究，還對工程菌的產(chǎn)酶發(fā)酵條件進行了優(yōu)化研究。主要的研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1.原核工程菌的構(gòu)建及表達：從Lact

2、obacillus plantarum WCFS1的基因組中擴增得到編碼鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的glycosyltransferase(rhamnosyltransferase),family2(GT2)基因，將該目的基因與表達載體pET-DsbA連接，得到重組表達載體pET-DsbA-GT2。將表達載體導入表達菌株BL21(DE3)，成功構(gòu)建得到了原核表達工程菌BL21(pET-DsbA-GT2)；采用誘導劑IPTG對工程菌BL21(pET-

3、DsbA-GT2)進行誘導表達，GT2與DsbA成功的融合表達，得到了56.7 kDa左右大小的融合蛋白（其中，GT2的大小為35.7 kDa，DsbA的大小為21 kDa）。表達方式為部分包涵體、部分可溶性表達。
　　2.鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶的分離純化及其酶學性質(zhì)的研究：通過分離純化分別得到了包涵體蛋白酶(GT2-1)、可溶性蛋白酶（GT2-2）兩種鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶。酶活測定結(jié)果顯示GT2-1的比活力為0.41 U/mg，遠低于可溶性目

4、的蛋白GT2-2的1.92 U/mg。酶學性質(zhì)的研究結(jié)果：GT2-1、GT2-2兩種酶的最適反應溫度38-40℃，最適pH值為6.0-6.5；GT2-1、GT2-2在20-40℃處理1 h后的酶活仍能達到90％以上，當溫度超過40℃時，GT2-1的酶活隨著溫度的升高迅速降低，當溫度達到70℃時便完全失去酶活，GT2-2溫度達到80℃才完全失去酶活；GT2-1、GT2-2在pH值在5-10這個范圍內(nèi)均具有較好的穩(wěn)定性。
　　3.重組