DON全抗原的生物合成及其在免疫分析中的應(yīng)用.pdf

1、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是在鐮孢霉屬真菌處于缺乏營(yíng)養(yǎng)的狀態(tài)下產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物，大麥、小麥、玉米等谷物及其制品是其主要污染物。污染地區(qū)遍布全球，其中我國(guó)是DON污染較嚴(yán)重的地區(qū)之一，尤其是在多雨年份。DON可引起人畜惡心、嘔吐、胃部不適、危害生殖系統(tǒng)甚至具有三致（致癌、致畸、致突變）危險(xiǎn)，因此近年來(lái)世界各國(guó)科研人員建立了多種DON的檢測(cè)方法。其中免疫分析法由于其簡(jiǎn)單、快速、低成本、高特異性等優(yōu)點(diǎn)而成

2、為DON檢測(cè)的重要檢測(cè)方法。但是像DON這樣小分子待測(cè)物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)過(guò)程往往需要制備檢測(cè)抗原，而傳統(tǒng)檢測(cè)抗原的制備過(guò)程往往需要專業(yè)的操作人員、復(fù)雜的分離純化過(guò)程及使用價(jià)格昂貴的DON標(biāo)準(zhǔn)品，同時(shí)制備過(guò)程中DON毒素和大量有機(jī)試劑的使用對(duì)操作人員的健康和環(huán)境的保護(hù)都會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的不利影響。
　　本研究采用噬菌體展示多肽技術(shù)，以抗DON單克隆抗體為靶分子，淘選DON多肽模擬表位，采用分子生物學(xué)技術(shù)合成了DON檢測(cè)抗原D8-MBP。并基于

3、D8-MBP建立了玉米、小麥、飼料中DON的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法（D8-MBP-ELISA）和膠體金免疫層析試紙條檢測(cè)方法（D8-MBP-GICA）。結(jié)果提示D8-MBP可以替代傳統(tǒng)DON-BSA抗原用于DON的免疫學(xué)檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了DON的無(wú)毒、低成本、快速檢測(cè)。主要研究結(jié)果如下：
　　1 DON模擬表位的淘選
　　以抗DON單克隆抗體（anti-DON-McAb）為靶分子，淘選噬菌體隨機(jī)十二肽庫(kù)，經(jīng)過(guò)三輪淘選，采取改變洗脫方式（

4、第一輪酸洗脫，第二、三輪DON標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)洗脫）、逐輪降低抗體包被濃度（100μg/mL～50μg/mL）、增加清洗液中的Tween-20濃度(0.1％～0.5%)、逐輪更換封閉劑（BSA、OVA）等措施逐輪增加篩選壓，成功獲得了一個(gè)能與DON標(biāo)準(zhǔn)品競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗DON單克隆抗體的噬菌體克隆，命名為D8?；贒8建立了Phage-ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線，IC50為44.70±0.88 ng/mL，線性范圍為8.24～231.19 ng/mL。

5、r>　　2 DON全抗原的生物合成
　　PCR擴(kuò)增D8基因。用Acc65 I和Eag I對(duì)目的基因和質(zhì)粒pMal-PIII分別雙酶切。通過(guò)T4 DNA連接酶將目的基因和質(zhì)粒pMal-PIII連接以構(gòu)建表達(dá)載體。將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至E.coliTB1中誘導(dǎo)表達(dá)，純化后獲得了DON全抗原D8-MBP，純度在80％以上。
　　3分別建立了基于D8-MBP的ELISA(D8-MBP-ELISA)和GICA(D8-MBP-GICA)3.1

6、 D8-MBP-ELISA的建立
　　采用D8-MBP-ELISA分析了pH值、鹽離子濃度以及熱處理對(duì)D8-MBP活性的影響。結(jié)果適宜pH值為7.4、適宜鹽離子濃度為10 mM，D8-MBP經(jīng)37℃熱處理3 h，活性不會(huì)明顯降低，但在60℃和90℃條件下隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)其活性降低明顯。D8-MBP-ELISA IC50為57.98±0.97 ng/mL，線性范圍為11.32~286.77 ng/mL，最低檢測(cè)限為9.83 ng

7、/mL，靈敏度比基于DON-BSA建立的ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（IC50：140.75 ng/mL）提高了近2倍。
　　3.2 D8-MBP-GICA的建立
　　采用兩步法合成了海膽狀膠體金，經(jīng)透射電鏡表征，直徑約為75 nm，粒徑較均一?；诤Ｄ憼钅z體金和D8-MBP建立了D8-MBP-GICA，方法閾值為25 ng/mL，相比于DON-BSA靈敏度（閾值：50 ng/mL）提高了1倍。
　　4實(shí)際樣品的檢測(cè)