基于模擬表位的玉米赤霉烯酮全抗原生物合成及其免疫學(xué)檢測(cè)性能的研究.pdf

1、真菌毒素(Mycotoxin)是一類由真菌產(chǎn)生的有毒次級(jí)代謝產(chǎn)物,大多顯示有特定的器官毒性及致癌性,是食物鏈中常見的化學(xué)性污染物之一,也是目前影響我國(guó)食品安全的主要因素。對(duì)食品中的真菌毒素進(jìn)行有效地監(jiān)控和檢測(cè)是防止其危害食品安全的重要手段。真菌毒素檢測(cè)技術(shù)經(jīng)過多年的研究,已經(jīng)發(fā)展衍生出眾多類型的檢測(cè)模式,其中又以競(jìng)爭(zhēng)型免疫檢測(cè)體系應(yīng)用最廣。
　　 建立小分子物質(zhì)免疫學(xué)檢測(cè)體系的前提和核心是全抗原的合成及抗體的制備。目前,小分子全

2、抗原的制備主要依賴于化學(xué)合成的途徑,然而該方法存在著合成步驟繁瑣、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、副產(chǎn)物多、批次誤差大等缺陷,特別是對(duì)于真菌毒素而言,其價(jià)格高昂且具致癌毒性,對(duì)操作人員及環(huán)境易造成毒害和污染,從而限制了免疫學(xué)檢測(cè)方法的廣泛使用。
　　 本研究以常見的真菌毒素一玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)為對(duì)象,通過噬菌體展示肽庫(kù)、外源基因表達(dá)及分子定向改造技術(shù),實(shí)現(xiàn)ZEN全抗原的生物合成,并將其應(yīng)用于免疫學(xué)檢測(cè)體系。主要研究?jī)?nèi)容為

3、:1)ZEN噬菌體展示抗原模擬表位(十二肽)的淘選、鑒定及其結(jié)構(gòu)研究;2)ZEN噬菌體展示抗原模擬表位免疫學(xué)檢測(cè)性能的研究;3)ZEN新型模擬表位表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及其免疫學(xué)檢測(cè)性能的研究;4)ZEN抗原模擬表位構(gòu)效關(guān)系的初步研究,主要研究結(jié)果如下:
　　 1、淘選獲得5種可特異性結(jié)合抗ZEN單抗(7G5)的ZEN噬菌體展示抗原模擬表位(十二肽),分別命名為Z5、Z8、Z14、Z15和Z18,采用ExPASy、Swiss-pd

4、bviewer軟件分析其理論等電點(diǎn)、熱穩(wěn)定指數(shù)、消光系數(shù)、平均親水性等物化性質(zhì)并進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),結(jié)果表明5種模擬表位的兩端均為無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu),中間為螺旋結(jié)構(gòu),理論等電點(diǎn)均小于7.0,對(duì)熱穩(wěn)定且具有親水屬性。
　　 2、建立了基于Z5、Z8、Z14、Z15、Z18的間接競(jìng)爭(zhēng)Phage-EIJSA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其IC50值分別為23.5±2.0、2.6±0.4、7.0±0.8、1.2±0.3、14±1.6ng/mL。在此基礎(chǔ)上,將

5、ZEN抗原模擬表位進(jìn)行了體外化學(xué)合成(多肽制備),并采用馬來酰亞胺法將多肽與HRP酶偶聯(lián),建立了基于Z5-、Z8-、Z14-、Z15-、Z18-HRP偶聯(lián)物的直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線,其IC50值分別為15±2.4,2.0±0.6,7.2±1.5,0.7±01,11±3.1ng/mL。
　　 3、采用SPR研究了ZEN噬菌體展示抗原模擬表位與7G5的生物相互作用及其反應(yīng)動(dòng)力學(xué),并進(jìn)行了結(jié)合、解離曲線的分析以及平衡解離常數(shù)KD值

6、的計(jì)算,結(jié)果顯示Z5(十二肽)、P4(七肽)與7G5均呈現(xiàn)良好的線性結(jié)合關(guān)系,兩者的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線相似,結(jié)合及解離點(diǎn)相近,其KD值分別為39.8,38.7nM,ZEN-BSA與7G5的KD值則為0.31nM。
　　 4、建立了基于ZEN噬菌體展示抗原模擬表位的固相膜免疫檢測(cè)方法,該方法對(duì)于谷物樣品中ZEN的Cut-off值為50μg/kg,檢測(cè)時(shí)間10min,且可肉眼判定結(jié)果;同時(shí)構(gòu)建了一種PVDF膜免疫快速檢測(cè)裝置,建立了可同

7、時(shí)檢測(cè)5種真菌毒素的PVDF膜免疫檢測(cè)方法,該方法對(duì)于谷物樣品中AFB1、ZEN、DON、OTA、FB1的Cut-off值分別為20,60,1000,20,250μg/kg,檢測(cè)時(shí)間10min且可肉眼判定結(jié)果。
　　 5、構(gòu)建了Z5-,Z8-,Z14-,Z15-,Z18-pMal-PⅢ和Z15-pRX-AP表達(dá)載體,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,分別獲得了Z5-,Z8-,Z14-,Z15-,Z18-MBP和Z15-AP融合蛋白,建立的間接競(jìng)

8、爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示均呈現(xiàn)典型的競(jìng)爭(zhēng)抑制關(guān)系,其IC50值分別為1.5±0.2,1.6±0.3,3.5±0.5,7.2±0.8,1.8±0.4ng/mL。Z15-AP融合蛋白與AP底物顯色液可顯色,但與ZEN抗體的結(jié)合能力較弱,OD值在0.3-0.5之間。
　　 6、研究了ZEN抗原模擬表位的串聯(lián)拷貝數(shù)、間隔臂及環(huán)化結(jié)構(gòu)與其免疫學(xué)檢測(cè)性能的關(guān)系,結(jié)果顯示串聯(lián)拷貝數(shù)、問隔臂并不是影響ZEN模擬表位免疫學(xué)檢測(cè)性能的關(guān)鍵因素;相比