致病微生物鐵代謝相關(guān)蛋白ViuP、FepB的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、作為地球上分布最廣的金屬元素，鐵在自然界中的含量可以說是相當(dāng)豐富，但是大部分鐵都是以難溶的氧化態(tài)存在，這種狀態(tài)的鐵元素難以被微生物利用。而且過量的鐵對生物體還有潛在的危害性，在富氧條件下，細(xì)胞內(nèi)的呼吸作用會產(chǎn)生一些過氧化物和H2O2，亞鐵離子能夠與過氧化氫通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生對生物體有害的氫氧根自由基，氫氧根自由基能夠通過氧化反應(yīng)破壞諸如蛋白質(zhì)、核酸、脂肪等生物大分子。因此，生物體需要精確控制體內(nèi)游離鐵的含量，在宿主體內(nèi)，冗余的鐵元

2、素被轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等鐵蛋白螯合掉，能供微生物利用的鐵元素少之又少。而鐵對于微生物的生長繁殖又是必需的，為了獲得鐵元素，一些細(xì)菌和真菌類能夠合成一種能夠高效螯合鐵離子的小分子化合物.鐵載體，來獲得所需要的鐵元素。從與鐵配位的亞體的角度來看，鐵載體可以分成四大類：兒茶酚型鐵載體、羥基氧肟酸型鐵載體、羧酸類鐵載體，還有一類是前面三類的混合型鐵載體。這些種類的鐵載體中，兒茶酚型鐵載體對鐵的親和力最高，這種鐵載體大部分是通過2，3-二羥基苯甲

3、酸亞體上的氧原子與鐵進(jìn)行六配位，其復(fù)合物表現(xiàn)出三個單位的負(fù)電荷。目前為止發(fā)現(xiàn)的對鐵親和力最高的兒茶酚型鐵載體-腸菌素與鐵作用，其解離常數(shù)可達(dá)10-52M。兒茶酚型鐵載體的另一個代表成員是由霍亂弧菌合成的弧菌素分子，它的分子骨架由反亞精胺、蘇氨酸和2，3-二羥基苯甲酸三部分構(gòu)成。
　　 微生物進(jìn)入宿主中之后，會通過合成鐵載體的方式來獲得鐵元素，為了應(yīng)對微生物的這種入侵，阻止微生物獲得所需要的鐵元素，哺乳動物能夠合成一種叫sider

4、ocalin的免疫蛋白，這種免疫蛋白后來證實(shí)它能夠高效地捕獲兒茶酚型鐵載體-腸菌素，Raymond等人通過用腸菌素對siderocalin熒光淬滅的實(shí)驗(yàn)得出siderocalin蛋白對腸菌素的親和力相當(dāng)高，解離常數(shù)可以達(dá)到納摩爾的級別。因此，腸菌素分子雖然對鐵的螯合性非常強(qiáng)，但在siderocalin免疫蛋白的作用下，螯合了鐵離子的腸菌素分子并不能被大腸桿菌收回運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)供其利用，從而在這個過程中siderocalin蛋白起到了免疫殺

5、菌的作用。為了逃避宿主siderocalin蛋白的免疫過程，一些致病腸道菌譬如沙門氏菌、克雷伯氏菌等能夠?qū)铣沙鰜淼哪c菌素進(jìn)行糖基化修飾，使得腸菌素的骨架變長，這樣經(jīng)過修飾的腸菌素由于骨架變大便不能被被siderocalin蛋白捕獲。這樣修飾腸菌素的代價(jià)是腸菌素不能保持像本體狀態(tài)那樣對鐵離子的極高的親和力，但是卻能夠逃避siderocalin免疫蛋白的捕獲，為致病腸道菌提供所必要的鐵元素。逃逸宿主siderocalin蛋白免疫過程的另一

6、個機(jī)制是炭疽桿菌的“偷襲機(jī)制”，它并不是在原有的鐵載體基礎(chǔ)上對其進(jìn)行修飾，而是在鐵載體合成過程中利用了一種在其他鐵載體中很少見的3，4-二羥基苯甲酸亞體，通過這個亞體上的氧原子與鐵進(jìn)行配位，與鐵配位后，Rebecca等人證實(shí)這種鐵載體在與siderocalin蛋白作用時會產(chǎn)生空間位阻，使得siderocalin免疫蛋白無法捕獲這種特殊的鐵載體。
　　 霍亂弧菌是霍亂的病原體，能夠引起嘔吐、腹瀉等癥狀?；【厥腔魜y弧菌在低鐵環(huán)境下

7、合成的一種兒茶酚型鐵載體，關(guān)于弧菌素分子與鐵離子的配位方式，Griffiths等人認(rèn)為其第二個惡唑環(huán)上的氮原子也參與了配位，即五個氧原子和一個氮原子與鐵配位，而Miethke等人認(rèn)為是三個兒茶酚亞體上的六個氧原子與鐵進(jìn)行配位，那么弧菌素分子到底通過什么原子和鐵離子配位，它是否也能逃逸siderocalin蛋白的免疫過程。并且，在體外環(huán)境中結(jié)合了鐵離子之后，弧菌素分子是如何被識別并轉(zhuǎn)運(yùn)至霍亂弧菌細(xì)胞內(nèi)部被利用也是人們比較關(guān)心的一個問題，這

8、些都可以通過結(jié)構(gòu)生物學(xué)的手段來解決。
　　 在弧菌素分子由細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)的過程中，ViuP蛋白是其中的周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它的作用是把帶鐵弧菌素由外膜孔蛋白ViuA轉(zhuǎn)運(yùn)到內(nèi)膜上的ABC體系ViuDGC蛋白，在帶鐵弧菌素的運(yùn)輸中起到了承前啟后的作用。我們的課題的第一部分就是試圖通過解析Viup蛋白和ViuP與帶鐵弧菌素復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)，來闡明ViuP蛋白與弧菌素分子的作用機(jī)制，以及弧菌素分子與鐵離子真正的配位模式。通過這部分的實(shí)

9、驗(yàn)，我們得到了以下結(jié)果：
　　 1)ViuP蛋白分子整體結(jié)構(gòu)是兩個相對獨(dú)立的球狀結(jié)構(gòu)域被一段α螺旋結(jié)構(gòu)連接，屬于第三類周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族，在帶鐵弧菌素結(jié)合前和結(jié)合后ViuP蛋白的整體結(jié)構(gòu)基本上不發(fā)生明顯變化：
　　 2)通過對比ViuP蛋白和其他兒茶酚型鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)ViuP蛋白的弧菌素結(jié)合口袋的方向與其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的底物結(jié)合口袋的方向相反，因此，ViuP蛋白從進(jìn)化角度上來說可能來源于不同于其他的

10、鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的新的家族；
　　 3)ViuP與帶鐵弧菌素的復(fù)合物的高分辨率結(jié)構(gòu)(1.45 A)證實(shí)弧菌素分子是通過五個氧原子和一個氮原子與鐵離子配位，這種獨(dú)特的配位方式使帶鐵弧菌素分子表現(xiàn)出兩個單位的負(fù)電荷；
　　 4)通過對siderocalin蛋白的熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，表明siderocalin不能像螯合腸菌素分子那樣高效地捕獲帶鐵弧菌素分子，分析判斷可能與帶鐵弧菌素分子特殊的鐵配位形式有關(guān)。
　　 本課題的另一

11、部分是關(guān)于腸菌素分子的周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能分析。作為最高效的兒茶酚型鐵載體，腸菌素結(jié)合蛋白目前已有一些研究，其外膜結(jié)合蛋白FepA的結(jié)構(gòu)于1999年被發(fā)表。FepA蛋白識別并結(jié)合帶鐵腸菌素分子后，將腸菌素轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)空間，在周質(zhì)空間內(nèi)，再由FepB蛋白將帶鐵腸菌素分子轉(zhuǎn)移給內(nèi)膜上的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)。FepB蛋白是如何識別并轉(zhuǎn)運(yùn)腸菌素分子，它與下游的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是如何相互作用的，我們通過解析FepB蛋白與帶鐵腸菌素復(fù)合物的結(jié)構(gòu)對這些

12、問題有了初步的回答。通過這部分的結(jié)構(gòu)與功能實(shí)驗(yàn)，我們得到了以下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1)FepB蛋白分子整體結(jié)構(gòu)也是兩個相對獨(dú)立的球狀結(jié)構(gòu)域被一段α螺旋結(jié)構(gòu)連接，符合第三類周質(zhì)空間轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的基本特征；
　　 2)通過對比FepB蛋白和ViuP蛋白以及其他的兒茶酚型鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)epB蛋白的腸菌素結(jié)合的口袋方向與ViuP蛋白一致，而與其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都相反，這說明FepB蛋白可能與ViuP蛋白來源于同

13、一個進(jìn)化的家族，而不是目前已經(jīng)報(bào)道的其他的鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族；
　　 3)復(fù)合物結(jié)構(gòu)的一個重要特征是FepB蛋白與帶鐵腸菌素分子是以3:4的比例結(jié)合，每三個結(jié)合了腸菌素分子的FepB蛋白中間還結(jié)合了一個額外的帶鐵腸菌素分子，這種結(jié)合比例模式在其他鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中從未見報(bào)道。通過對加入不同濃度腸菌素分子的FepB蛋白溶液的動態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)高濃度的帶鐵腸菌素分子能夠使FepB蛋白的聚合態(tài)由單體轉(zhuǎn)變?yōu)槿w，據(jù)此我們推測，F(xiàn)ep

14、B蛋白除了具有轉(zhuǎn)運(yùn)腸菌素的作用，可能還具有儲存帶鐵腸菌素的功能，從而防止冗余的帶鐵腸菌素分子通過TolC系統(tǒng)溢出，提高了大腸桿菌對腸菌素分子的利用率；
　　 4)通過序列比對和結(jié)構(gòu)疊合我們找到了FepB蛋白上可能與下游FepDG蛋白作用的兩個保守的酸性氨基酸殘基Glu-109和Glu-251。在驗(yàn)證這兩個氨基酸殘基的重要性時我們發(fā)現(xiàn)這兩個氨基酸的重要程度并不一致。Glu-251氨基酸突變掉之后，回補(bǔ)的fepB敲除的大腸桿菌在限鐵