水稻白葉枯病抗性突變體的篩選與高分辨率溶解曲線在水稻中的應(yīng)用.pdf

1、水稻白葉枯病是水稻重要病害之一,對(duì)水稻生產(chǎn)造成了嚴(yán)重的危害。新的白葉枯病抗性種質(zhì)資源的獲得對(duì)于水稻抗白葉枯病育種具有重要意義。
　　 本研究對(duì)5萬(wàn)個(gè)T-DNA突變體株系進(jìn)行了系統(tǒng)的大田篩選。從5葉期開(kāi)始,每個(gè)株系經(jīng)過(guò)4輪的白葉枯病菌P10接種,研究初篩獲得了一些白葉枯病抗性植株,對(duì)其中2個(gè)表型較好的植株進(jìn)行了初步的生理研究。同時(shí),在突變體庫(kù)中觀察獲得了一些其他表型突變的株系。為加快水稻突變體基因定位,本研究嘗試?yán)酶叻直媛嗜芙馇?/p>

2、線技術(shù)(high resolution melting,HRM)進(jìn)行水稻F2群體基因分型,為后期將HRM用于突變體中抗性基因定位探索條件。目前,已取得的主要研究結(jié)果有:
　　 1.通過(guò)T-DNA突變體庫(kù)大田種植觀察及接種P10菌株,初篩獲得了125個(gè)M0代白葉枯病抗性突變體。同時(shí),獲得了一些具有其他表型變化的突變體株系,如類病變突變體,葉色突變體,穎花退化,穗頸長(zhǎng)度變化,有芒與無(wú)芒,穎殼變化,高矮稈突變,葉形突變等。
　　

3、 2.對(duì)初篩獲得的125個(gè)M0代白葉枯病抗性突變體中的17個(gè)株系的M1代進(jìn)行了對(duì)P10菌株的抗性鑒定,結(jié)果表明2個(gè)株系BBM14和BBM66的M1代對(duì)P10菌株抗性穩(wěn)定,且BBM14和BBM66的M1代植株無(wú)明顯抗性分離。同時(shí),轉(zhuǎn)基因PCR檢測(cè)表明T-DNA插入已經(jīng)純合,因此,需要設(shè)計(jì)專門(mén)實(shí)驗(yàn)來(lái)判斷BBM14和BBM66的抗性是否由T-DNA插入引起。對(duì)接種P10后葉片內(nèi)部的菌株生長(zhǎng)情況進(jìn)行生長(zhǎng)曲線分析表明,P10菌株在BBM14和B

4、BM66中的生長(zhǎng)相對(duì)于親本中花11明顯受到抑制,由此進(jìn)一步證實(shí)了BBM14和BBM66對(duì)P10菌株的抗性。對(duì)BBM14和BBM66的抗譜分析發(fā)現(xiàn),BBM14對(duì)白葉枯病菌株菲律賓生理小種P2(PXO86),P3(PXO79),P7(PXO145),P8(PXO280),P10(PXO124)表現(xiàn)抗性,對(duì)P4(PXO71),P6(PXO99)表現(xiàn)感病。BBM66對(duì)P2,P7,P8,P10菌株表現(xiàn)出抗性,對(duì)P3,P4,P6表現(xiàn)感病。同時(shí),將B

5、BM14和BBM66抗譜與已知白葉枯病抗性基因抗譜比較后發(fā)現(xiàn),兩者的抗譜與這些白葉枯病抗性基因抗譜都不同,因此,初步判斷BBM14和BBM66中均具有新的白葉枯病抗性基因。對(duì)BBM14和BBM66中的部分防衛(wèi)相關(guān)基因進(jìn)行表達(dá)分析,結(jié)果表明接種P10菌株后OsPR16基因表達(dá)上調(diào)。
　　 3.本研究嘗試將HRM用于水稻F2群體基因分型,同時(shí)進(jìn)行了HRM反應(yīng)條件優(yōu)化,為后續(xù)將HRM用于BBM14和BBM66中抗性基因定位打下了基礎(chǔ)。

6、利用本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)制的高抗白葉枯病材料Y73以及高感白葉枯病材料IR24雜交以構(gòu)建F2群體,選取了22株F2植株。在5μl反應(yīng)體系及普通PCR程序條件下,本研究對(duì)353對(duì)STS和SSR分子標(biāo)記進(jìn)行了Y73,IR24以及其F1之間多態(tài)HRM分子標(biāo)記篩選,其中103對(duì)分子標(biāo)記表現(xiàn)出多態(tài)的HRM曲線。將這103對(duì)多態(tài)HRM分子標(biāo)記用于以上F2群體的HRM基因分型,結(jié)果顯示在5μl反應(yīng)體系及普通PCR程序條件下,12對(duì)STS和SSR分子標(biāo)記成功地對(duì)

7、該F2群體進(jìn)行了基因型分析。傳統(tǒng)的凝膠電泳結(jié)果顯示,HRM基因分型結(jié)果與傳統(tǒng)的PCR后電泳檢測(cè)結(jié)果完全一致。為提高STS與SSR分子標(biāo)記用于HRM基因分型的效率,本研究在另外兩種HRM反應(yīng)條件下,對(duì)這103對(duì)多態(tài)HRM分子標(biāo)記用于該F2群體基因分型進(jìn)行了重新的篩選。在5μl反應(yīng)體系與降落PCR程序中,篩選效率沒(méi)有明顯提高,而在10 μl反應(yīng)體系與降落PCR程序中,除了這12對(duì)分子標(biāo)記外,另外9對(duì)分子標(biāo)記成功地對(duì)該F2群體進(jìn)行了基因分型,

8、篩選效率明顯提高。因此,以上結(jié)果表明HRM用于水稻F2群體的基因分型具有可行性,且3種HRM體系中,10 μl反應(yīng)體系與降落PCR程序條件時(shí)的HRM體系更穩(wěn)定,更適宜于水稻F2群體基因分型。
　　 綜合以上研究結(jié)果表明,突變體BBM14和BBM66對(duì)部分白葉枯病菌抗性穩(wěn)定,可進(jìn)行進(jìn)一步的白葉枯病抗性基因研究。同時(shí),HRM技術(shù)在水稻F2群體基因分型中具有可行性,因此,將HRM技術(shù)應(yīng)用于BBM14和BBM66相關(guān)抗性基因的研究對(duì)于同