高分辨率溶解曲線(HRM)技術在高血壓患者MTHFR基因多態(tài)性篩查中的應用.pdf

1、目的:
　　H型高血壓為伴有高同型半胱氨酸血癥(homocysteine，Hcy)的原發(fā)性高血壓，近年來越來越受到人們的重視，它以血Hcy水平增高為特點（Hcy≥10μmol/L），是動脈粥樣硬化的獨立危險因素，與外周血管病變、腦血管病變、高血壓、高血壓性心臟病、冠狀動脈阻塞及血栓形成的發(fā)生密切相關。
　　人類亞甲基四氫葉酸還原酶(methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR)是葉酸代謝

2、中的關鍵酶之一，可將還原型輔酶Ⅰ(NADPH)相關的5，10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸，這一代謝途徑的正常運轉在維持血漿中同型半胱氨酸正常水平中至關重要。MTHFR常見的突變?yōu)?77位堿基C被T置換，產(chǎn)生Ala222 Val錯義突變，這一突變位于葉酸結合結構域。MTHFR的C667T錯義突變，可降低血液中5-甲基四氫葉酸水平和升高Hcy水平，從而干擾DNA合成和損傷修復，引發(fā)包括H型高血壓在內的多種疾病。因此，本課題組開展的

3、在高血壓患者中篩查MTHFR基因多態(tài)性十分必要，但是現(xiàn)有臨床使用的SNP位點檢測，常為一代測序，耗時長，成本高，已經(jīng)滿足不了臨床檢測的需要，也不適合大規(guī)模用于MTHFR C667T的流行病學調查研究。
　　高分辨率溶解曲線分析技術(High Resolution Melting, HRM)是結合飽和熒光染料、未標記探針和實時熒光定量PCR的一種新的檢測基因突變與基因分型的分子診斷技術，具有高通量、低成本、簡單快捷、準確、靈敏度和特

4、異性高和真正閉管操作等優(yōu)點。其次，傳統(tǒng)DNA樣本往往從血液中抽提DNA，即收集病人的血樣標本，這種方法有幾個明顯的缺點:需要具備醫(yī)務人員及一定的采血設備;抽血的疼痛造成排斥拒絕采樣;侵入性采集增加了感染的可能性;采集后血樣必須低溫運輸保存。而從唾液中抽提DNA可以避免以上缺點，可提供無疼痛、非侵入性的方法，無需忍受抽血的疼痛和感染的風險，即可獲得高質量、高數(shù)量的樣品，受測者排斥性低，嬰兒和老人都能方便地獲得DNA樣本。
　　因此，

5、本課題旨在將唾液抽提DNA和HRM技術結合起來，建立一種快速檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性的方法。
　　方法:
　　收集2014年1月-2014年7月在我院心血管內科門診治療的500例高血壓患者，再從我院體檢中心選取500例健康人員為健康對照組，每人收集唾液2mL及全血200ul，使用昌美生物的Just-a-TubeTM唾液DNA提純試劑盒提取唾液DNA，使用上海凡濟生物科技有限公司的全血DNA抽提試劑盒提取全血NDA，

6、測定兩者抽提DNA的OD260/280比值并比較，評估從唾液抽提DNA用于后續(xù)HRM法的可行性。
　　根據(jù)Genbank上MTHFR的基因序列，采用引物設計軟件Primer5設計MTHFR SNP位點c.677C＞T的特異性引物以及測序引物，優(yōu)化反應條件，直接應用Bio-Rad CFX Manager進行PCR擴增以及HRM分析。并將擴增產(chǎn)物進行測序，比較兩種方法的靈敏度和特異性。
　　采用EDTA抗凝管收集患者空腹靜脈血4

7、ml，測定血Hcy和葉酸水平，高血壓患者根據(jù)MTHFR C667T不同基因型分為CC、CT、TT型，比較三組之間Hcy和葉酸水平，初步探討MTHFR C667T基因多態(tài)性對Hcy水平的影響。
　　結果:
　　1)唾液和血液DNA濃度比較:我們用武漢昌美生物技術有限公司的唾液抽提DNA試劑盒提取了500份高血壓患者和500份正常對照組的唾液樣本，抽提的DNA均檢測了OD260/280的比值，結果顯示，平均OD260/280為1

8、.809(95％CI1.791-1.827)。采用上海凡濟生物科技有限公司的全血DNA抽提試劑盒提取了500份高血壓患者和500份正常對照組的全血標本，平均OD260/280為1.823，95％CI1.720-1.854。唾液抽提出的DNA純度與全血抽提的DNA結果純度相近。
　　2)成功構建一種快速檢測MTHFR基因C677T多態(tài)性的HRM法:HRM法引物:Forward primer, TGAGGCTGACCTGAAGCA,

9、Reverse primer,TGTCAGCCTCAAAGAAAA。20μl反應體系中最佳反應體系為:引物濃度0.8μmol/L，2×Eva Green premix10μl，DNA5 ng，雙蒸水4.2μl。設定程序為兩步法Real-Time PCR:預變性95℃，1分鐘;之后每一步變性95℃，5S;退火延伸60℃，20 S;共進行40個循環(huán)。每次在延伸階段讀取吸光值。HRM分析條件:PCR結束后從65℃開始到95℃，循環(huán)上升0.2℃

10、，維持20 S，并檢測熒光。
　　3)MTHFR C667T HRM法檢測結果與測序結果比較:1000例受試者用本研究建立的HRM法檢測出270例(27.0％)CC型，425例(42.5％)CT型和305例(30.5％)TT型。1000例樣本再用測序檢測，結果提示，268例(26.8％) CC型，426(42.6％)CT型和306例(30.6％)TT型。HRM法有兩例檢測結果與測序結果不符，準確率為99.8％。
　　4)不同

11、分型的高血壓患者血漿Hcy和葉酸水平比較:MTHFR C667T根據(jù)不同基因型分為CC、CT和TT型，TT型高血壓患者血漿Hcy水平明顯高于CC型和CT型(P＜0.01)，葉酸水平，CT和TT型顯著低于CC型(P＜0.01)。
　　研究結論:
　　1 本研究將無創(chuàng)的唾液抽提DNA法應用于HRM前的DNA抽提純化，并證實了其可行性，減輕患者采血取樣的痛苦;
　　2 通過測序技術對HRM篩查結果的驗證，初步證實了HRM技術