基于DNA條形碼的分子生物學方法鑒定海參種類的研究.pdf

1、海參是我國傳統(tǒng)的海洋食物和藥物資源。近年來，隨著對海參研究的不斷深入，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)海參具有提高機體免疫力、抗腫瘤、促進造血功能、抗凝血和降血脂等多種生理功效，海參及海參產(chǎn)品也因此得到越來越多的關(guān)注。海參膠囊、即食海參、海參口服液等產(chǎn)品的出現(xiàn)，豐富了海參產(chǎn)品的種類，進一步提升了海參的價值。傳統(tǒng)的海參鑒定方法主要依據(jù)海參的外部形態(tài)和解剖特征，但這種方法不適用于加工后的海參的種類鑒定。因此建立快速、簡便的海參種類鑒定方法，對于規(guī)范海參市場、

2、保護消費者權(quán)益至關(guān)重要，對加快海參產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展具有重要的意義。
　　 隨著DNA條形碼概念的提出，基于DNA條形碼的分子生物學技術(shù)取得了快速發(fā)展，在種類鑒定領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用。本論文研究了海參線粒體細胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(Mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠ，COⅠ)基因作為DNA條形碼用于海參種類鑒定的可行性。利用DNAstar6.1、DNAMAN6.0和MEGA4.1軟

3、件對海參線粒體COⅠ基因序列進行分析，計算不同海參的堿基組成，海參的種間遺傳距離和種內(nèi)遺傳距離，分別利用鄰接法和最大簡約法構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。結(jié)果表明：海參的種間遺傳距離顯著大于種內(nèi)遺傳距離，同種海參不同個體在系統(tǒng)樹中分別形成各自獨立的分支，表明以COⅠ基因作為海參DNA條形碼進行種類鑒定具有一定的可行性。
　　 在DNA條形碼的基礎(chǔ)上，建立了斑點雜交方法用于四種常見經(jīng)濟海參種類的鑒定。首先利用DNAStar6.1對加州擬刺參(P

4、arastichopus californicus)，北大西洋瓜參(Cucumaria frondosa)，仿刺參(Apostichopus japonicas)及梅花參(Thelenota ananas)四種海參的線粒體COⅠ基因序列進行比對分析，然后采用Primer premier5.0軟件設(shè)計四種海參的特異性探針，用于斑點雜交實驗，結(jié)果顯示，本實驗設(shè)計的四條探針具有高度的特異性，靈敏度可達100ng，能夠?qū)崿F(xiàn)四種海參的準確鑒定。<

5、br>　　 根據(jù)對四種海參線粒體COⅠ基因的比對結(jié)果，采用Primer premier5.0設(shè)計合成了四組特異性引物，建立了多重PCR方法用于四種海參種類的鑒定。仿刺參、梅花參、加州擬刺參和北大西洋瓜參的擴增片段長度分別為212bp、301bp、261bp和358bp，能夠通過電泳得到區(qū)分。對多重PCR的特異性和靈敏度進行研究，結(jié)果表明，四組引物具有高度的特異性，靈敏度達到ng級；對不同海參的混合樣品進行多重PCR鑒定，結(jié)果顯示該方法

6、能夠同時檢測混合樣品中的所有海參種類。表明多重PCR方法是一種特異性強、靈敏度高、重復性好的海參種類鑒定方法。
　　 采用DNAMAN6.0對加州擬刺參(Parastichopus californicus)，北大西洋瓜參(Cucumaria frondosa)，仿刺參(Apostichopus japonicas)，梅花參(Thelenotaananas)及輻肛參(Actinopyga lecanora)線粒體COⅠ基因進行分

7、析，建立酶切圖譜，選擇BamHⅠ，KpnⅠ，PstⅠ，XbaⅠ，Eco31Ⅰ用于五種海參的PCR-RFLP的分析。采用限制性內(nèi)切酶對五種海參線粒體COⅠ基因進行酶切，酶切結(jié)果與分析結(jié)果吻合，沒有非特異性酶切條帶的出現(xiàn)。對不同海參的混合樣品進行了鑒定，結(jié)果表明，本研究建立的PCR-RFLP方法能同時鑒定兩種海參。說明建立的PCR-RFLP是一種簡單、快速、可靠的海參種類鑒定方法。
　　 分別采用斑點雜交、多重PCR、PCR-RFL