2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、隨著社會(huì)的發(fā)展進(jìn)步,人們對全身和局部的電離損傷的擔(dān)心愈來愈大,這些電離損傷來源于:核電站事故、惡性腫瘤治療性的輻射、長時(shí)間的X線透視、核醫(yī)學(xué)中過量放射性材料的吸入、核爆炸性恐怖事件等。機(jī)體損傷后出現(xiàn)協(xié)調(diào)的愈合過程,其中包括多種細(xì)胞、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)之間錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)作用。正常創(chuàng)面愈合是由旁分泌或自分泌的許多細(xì)胞因子或生長因子介導(dǎo)和調(diào)控的級聯(lián)放大反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的。放創(chuàng)復(fù)合傷難愈創(chuàng)面的愈合過程紊亂,修復(fù)細(xì)胞數(shù)量減少或功能受損,導(dǎo)致對創(chuàng)面愈合起

2、重要作用的生長因子合成降低,膠原合成和炎性細(xì)胞減少等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow-derivedmesenchymAlstem cells,BMSCs)促進(jìn)傷口愈合的功能性特征包括:能夠移行到創(chuàng)傷或炎癥的部位,參與受損組織的再生與重建,刺激固有的祖細(xì)胞增殖和向不同方向分化,通過分泌生長因子和重新塑造細(xì)胞來促進(jìn)受損細(xì)胞的恢復(fù),發(fā)揮特殊的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。有效地把BMSCs作為一種修復(fù)細(xì)胞和/或外源基因表達(dá)的載體來運(yùn)用于臨床

3、是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endotheliAlgrowth factor,VEGF)的功能是作為促內(nèi)皮細(xì)胞分裂劑,趨化性媒介物和血管滲透性的誘導(dǎo)物,它是在創(chuàng)傷愈合級聯(lián)中唯一的起多重功能作用的因子,包括血管發(fā)生、內(nèi)皮形成和膠原沉積。局部微生物的持續(xù)感染也是創(chuàng)面難愈或不愈的原因之一。防御素富含正電荷,作用于細(xì)胞膜,具有廣譜高效的殺菌活性。由于其獨(dú)特的作用機(jī)制,幾乎無耐藥性,其中人β防御素3(humanbet

4、a defensins,hBD-3)在人類預(yù)防和治療感染性疾病方面發(fā)揮了重要作用,其在很小劑量范圍內(nèi)就表現(xiàn)出對革蘭陽性菌的抗菌活性,同時(shí)其抗菌活性是非鹽離子濃度敏感性的,也不引起溶血,分子量小,合成快,彌散快,不傷害人體組織細(xì)胞,是理想的抗感染的活性抗菌肽。研究顯示hBD-3的重組體和化學(xué)合成的hBD-3的抗菌性和生物學(xué)特性與分離出來的天然肽沒有區(qū)別。
   為了研究促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷等慢性難愈性損傷的愈合,我們構(gòu)建了pVIVO1-

5、hVEGF165-hBD-3真核質(zhì)粒載體,用于轉(zhuǎn)染大鼠的BMSCs,并將hVEGF165/hBD-3基因修飾的BMSCs移植到大鼠放創(chuàng)復(fù)合傷的傷口皮下,以期大量合成釋放hVEGF165和hBD-3,共同促進(jìn)創(chuàng)面愈合。主要方法和結(jié)果如下:
   1.hVEGF165/hBD-3 雙基因共表達(dá)真核質(zhì)粒載體的構(gòu)建和鑒定。利用RT-PCR 方法分別從白血病細(xì)胞(HL60)和牙齦組織中擴(kuò)增出hVEGF165和hBD-3基因片段,通過DNA

6、 重組技術(shù)將基因片段先后重組于pVIVO1-mcs 真核表達(dá)載體上,構(gòu)建成重組質(zhì)粒載體pVIVO1-hVEGF165和pVIVO1-hVEGF165-hBD-3,分別用酶切電泳分析及DNA 測序的方法對重組質(zhì)粒載體進(jìn)行鑒定。運(yùn)用jetPEI 轉(zhuǎn)染試劑將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后,采用RT-PCR、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)和Western blot方法證實(shí)重組真核質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后,能成功高表達(dá)外源基因hVEGF165和hBD-3。
  

7、 2.重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3轉(zhuǎn)染BMSCs后表達(dá)產(chǎn)物活性鑒定。分別收集轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3(T)、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165(C1)、轉(zhuǎn)染空載體(C2)以及正常未轉(zhuǎn)染(N)的BMSCs無血清培養(yǎng)上清,分別命名為T-CM,C1-CM,C2-CM和N-CM。為了檢測分泌出的hVEGF165能刺激細(xì)胞增殖和移行,另外設(shè)立了一組T-CM/Ab,即T-CM中加入hVEG

8、F165中和抗體,用來阻斷hVEGF165的作用效應(yīng)。
   將生長狀態(tài)良好的內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926按4×103/孔接種于含有100μL/孔完全培養(yǎng)基的96孔板中。常規(guī)培養(yǎng)24小時(shí)后,每孔更換上述5種條件培養(yǎng)基,按CCK-8試劑盒的說明連續(xù)檢測5d以觀察增殖效應(yīng)。結(jié)果顯示:與 C2-CM、N-CM和T-CM/Ab組相比,T-CM和C1-CM組在第1-4d能夠顯著的促進(jìn)細(xì)胞增殖(p<0.05),表明表達(dá)的外源基因hVEGF165

9、有促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。將內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926接種于12孔板,待其達(dá)到95%的融合時(shí),用一無菌的1mL移液頭,在培養(yǎng)板孔中央垂直交叉劃出一個(gè)“十”,使單層細(xì)胞形成劃痕,再用PBS沖洗2次,之后再每孔中加入1mL上述5種條件培養(yǎng)基。劃痕后0、4、8、12和18 h時(shí)用倒置顯微鏡于“十”兩側(cè)固定區(qū)域攝像。運(yùn)用圖像分析處理軟件測量愈合率。結(jié)果顯示T-CM和C1-CM組在劃痕后第4、8、12和18h的愈合率明顯高于C2-CM、N-CM和T-C

10、M/Ab組(p<0.05),表明表達(dá)的外源基因hVEGF165有促進(jìn)細(xì)胞遷移的作用。對上述四種培養(yǎng)上清進(jìn)行冷凍干燥、重溶,獲取20倍濃縮液,然后采用K-B紙片法觀察其對大腸埃希菌(EC, ATCC25922)、綠膿桿菌(PA,ATCC27853)、金黃色葡萄球菌(SA,ATCC25923)、枯草芽孢桿菌(BS,ATCC62037)和白色念珠菌(真菌,CA, ATCC10231)
   的抗菌效應(yīng)。結(jié)果顯示,T組培養(yǎng)上清濃縮液出現(xiàn)

11、顯著抑菌環(huán),其它組沒有抑菌環(huán)。表明重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs后,表達(dá)的外源基因hBD-3有抑制細(xì)菌和真菌的作用。
   3.重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3轉(zhuǎn)染BMSCs后局部移植對放創(chuàng)復(fù)合傷創(chuàng)面修復(fù)的影響。復(fù)制大鼠放創(chuàng)復(fù)合傷全層皮膚缺損創(chuàng)面,以局部點(diǎn)狀注射移植轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165-hBD-3的BMSCs為T組,以注射移植轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVIVO1-hVEGF165的BMSCs為C組,以注射移植

12、正常未轉(zhuǎn)染的BMSCs為N組,以注射PBS為S組。在移植后1d、3d、7d、13d和20d,大體觀察創(chuàng)面愈合情況,同時(shí)測定殘留面積和愈合時(shí)間。各時(shí)相點(diǎn)分別取材,石蠟切片經(jīng)HE染色,觀察各組各時(shí)相點(diǎn)創(chuàng)面的病理形態(tài)變化;石蠟切片經(jīng)Sirius red染色后,偏振光顯微鏡下觀察膠原纖維含量的變化;免疫組織化學(xué)染色觀察外源基因hVEGF165/hBD-3和創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)層粘連蛋白(Laminin)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,大體觀察,在各時(shí)相點(diǎn),與C

13、、N、S組比較,T組創(chuàng)面感染程度較輕,愈合速度較快,創(chuàng)面平均愈合時(shí)間為20d,而C、N、S組的平均愈合時(shí)間是22-23、24-25和27-28d。
   移植術(shù)后7d、13d和20d時(shí),T組中剩余殘留面積百分比顯著低于其它3組(P<0.05);HE染色結(jié)果證實(shí)T組有更好的肉芽組織形成;膠原纖維Sirius red染色結(jié)果表明,T組膠原纖維含量和厚度明顯高于其它3組;創(chuàng)面免疫組織化學(xué)觀察到, T組中外源基因hVEGF165/hBD

14、-3大量表達(dá),而且創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)反映血管基底膜形成的Laminin表達(dá)呈強(qiáng)陽性。T組與C組的差異可以推測:hBD-3在創(chuàng)傷愈合中也許發(fā)揮了一定的作用,也許與hBD-3的抗微生物的活性有關(guān)。C組與N組的差異可以推測:hVEGF165固有的促內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管發(fā)生的特性也許在創(chuàng)傷愈合過程中發(fā)揮了一定的作用。局部移植雙基因修飾后的BMSCs確實(shí)能促進(jìn)創(chuàng)傷愈合,這也許緣于分泌促內(nèi)皮細(xì)胞增殖、血管發(fā)生的hVEGF165和抗微生物的hBD-3,才導(dǎo)

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