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文檔簡(jiǎn)介
1、甲醛是香菇特征風(fēng)味物質(zhì)形成過(guò)程中的副產(chǎn)物之一,γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和半胱氨酸亞砜裂解酶(C-Slyase)是風(fēng)味形成途徑中的關(guān)鍵酶。本研究旨在通過(guò)揭示關(guān)鍵酶對(duì)香菇內(nèi)源性甲醛生成的作用來(lái)闡明風(fēng)味形成途徑對(duì)內(nèi)源性甲醛形成的貢獻(xiàn)。第一,分離純化了香菇C-Slyase,并研究了該酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和部分酶學(xué)性質(zhì);第二,克隆得到香菇GGT基因全長(zhǎng)cDNA序列,并研究了GGT基因mRNA表達(dá)水平的組織特異性、表達(dá)規(guī)律和不同儲(chǔ)藏條件下的表達(dá)差異以及
2、在相應(yīng)條件下與甲醛生成之間的相關(guān)性。第三,通過(guò)添加外源物質(zhì)和調(diào)整香菇培養(yǎng)基配方,直接或者間接調(diào)控GGT基因mRNA表達(dá)水平及其與C-Slyase酶活和特征風(fēng)味物質(zhì)的形成,量化了GGT和C-Slyase對(duì)香菇內(nèi)源性甲醛生成的作用。主要研究結(jié)果如下:
1、C-Slyase的分離純化及酶學(xué)性質(zhì)的研究
(1)C-Slyase的快速分離純化及其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)
本研究主要通過(guò)兩個(gè)關(guān)鍵步驟實(shí)現(xiàn)了對(duì)香菇中C-Sly
3、ase的快速分離和純化,即先用PEG6000沉淀蛋白,然后經(jīng)羥基磷灰石柱進(jìn)一步分離,純化倍數(shù)為234.82,得率為12.36%。純化后的C-Slyase變性瓊脂糖凝膠電泳(SDS-PAGE)、非變性瓊脂糖凝膠電泳(Native-PAGE)和高效液相色譜(HPLC)研究結(jié)果表明,分離得到的C-Slyase具有較高純度,同時(shí)該酶是由兩個(gè)分子量約為44KDa的亞基組成的二聚體。通過(guò)氨基酸分析發(fā)現(xiàn),C-Slyase由17種氨基酸組成,甲硫氨酸、
4、丙氨酸和苯丙氨酸未被檢出,酪氨酸含量最高(55%),其中酸性氨基酸與堿性氨基酸的比例為13.06/3.14。
(2)C-Slyase酶學(xué)性質(zhì)的研究
酶學(xué)性質(zhì)的研究結(jié)果表明,C-Slyase的等電點(diǎn)在pH4.75左右,最適反應(yīng)pH和溫度分別在7.5左右和35℃左右,并且具有較好的熱穩(wěn)定性,該酶對(duì)S-甲基-L-半胱氨酸亞砜的催化效率顯著高于它對(duì)S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜和S-甲基-D-半胱氨酸亞砜的催化效率。此
5、外,Cys和GSH以及Zn2+等金屬離子對(duì)該酶的活性有抑制作用,而Lys則對(duì)酶活有促進(jìn)作用。
2、香菇GGT基因cDNA全長(zhǎng)克隆及其mRNA表達(dá)水平
(1)香菇GGT基因cDNA全長(zhǎng)克隆及序列分析
通過(guò)RACE技術(shù)克隆得到香菇GGT基因cDNA序列全長(zhǎng)共2063bp(Genebank登錄號(hào)為JX123478),包括5’非翻譯區(qū)序列36bp,開(kāi)放讀碼框(ORF)序列1914bp,3'非翻譯區(qū)序列1
6、13bp。ORF序列分析結(jié)果表明,該序列可編碼由637個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì),分子量約為70KDa,并且含有GGT基因家族的保守核心結(jié)構(gòu)域。BLAST結(jié)果表明,GGT氨基酸序列與裂褶菌、玉米絲黑穗病菌、皺木耳的同源性分別為94%、94%、92%。
(2)GGT基因在香菇生長(zhǎng)過(guò)程、不同部位、不同儲(chǔ)藏溫度下的mRNA表達(dá)水平
生長(zhǎng)過(guò)程研究結(jié)果表明,GGT基因mRNA表達(dá)水平隨著香菇子實(shí)體的成熟先升高后降低,在第
7、三個(gè)生長(zhǎng)階段達(dá)到最高表達(dá)量;不同部位的研究結(jié)果表明,菇柄中GGTmRNA的水平顯著高于菇蓋中的水平;不同品種研究結(jié)果表明,GGT基因在品種806中的mRNA表達(dá)水平高于在品種808中的表達(dá)水平;不同溫度(4℃、20℃、30℃)儲(chǔ)藏香菇的研究表明,GGT基因的mRNA表達(dá)量隨著儲(chǔ)藏溫度的升高而降低;通過(guò)測(cè)定相應(yīng)條件下甲醛的含量發(fā)現(xiàn),GGT基因mRNA的表達(dá)與甲醛的生成規(guī)律基本一致。
3、風(fēng)味形成途徑對(duì)香菇內(nèi)源性甲醛生成的影響
8、
(1)直接添加從香菇中純化得到的GGT和C-Slyase能顯著提高香菇勻漿中甲醛的生成量;通過(guò)絲氨酸-硼酸復(fù)合物、GSH、Cys以及金屬離子(Na+、K+、Mg2+、Zn2+)抑制或者促進(jìn)GGT和C-Slyase的酶活,勻漿中甲醛的生成量也顯著的降低或者提高;改變香菇勻漿的酸堿度,甲醛的生成量隨著隨之改變,在pH8.0左右達(dá)到最大值,并且在弱堿性環(huán)境下(pH7~9)的甲醛生成量高于在弱酸性條件下(pH5~7)的生成量。<
9、br> (2)通過(guò)改變香菇培養(yǎng)基中含硫物質(zhì)(MgSO4)的含量(0.1%、0.2%、0.4%)發(fā)現(xiàn),香菇中甲醛的生成量隨著含硫物質(zhì)的增加而提高,同時(shí)發(fā)現(xiàn)香菇特征風(fēng)味物質(zhì)(1,2,4,5-四硫雜環(huán)己烷、香菇精)以及特征風(fēng)味物質(zhì)前體(S-丙烯基-L-半胱氨酸亞砜、S-甲基-L-半胱氨酸亞砜)、GGTmRNA水平和酶活以及C-Slyase的酶活的變化均與甲醛的生成規(guī)律基本一致。
綜上所述,能夠調(diào)控GGT基因表達(dá)水平、GGT
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