基于EXOⅢ酶的熒光信號(hào)放大探針的高靈敏基因檢測(cè)及凝膠電泳技術(shù)篩選細(xì)胞核酸適配體.pdf

1、本文對(duì)信號(hào)放大技術(shù)及其在基因檢測(cè)方面的應(yīng)用作了相關(guān)研究。首先，用活化的PAA（MW=8000）交聯(lián)Fe3O4磁性納米粒制得表面帶有活化羧基的Fe3O4磁珠。利用氨基-羧基反應(yīng)將氨基化的熒光核酸探針固定在 Fe3O4磁珠表面，制備了熒光核酸探針-Fe3O4磁珠復(fù)合物。Fe3O4磁珠不僅能夠作為分離載體，還能夠有效淬滅熒光核酸探針上的熒光基團(tuán)，降低了背景熒光信號(hào)，為后續(xù)熒光信號(hào)放大奠定了基礎(chǔ)。在加入待測(cè)靶分子后，靶分子與熒光核酸探針通過堿基

2、互補(bǔ)形成雙鏈，利用核酸外切酶EXOⅢ獨(dú)特的水解特性，使得EXOⅢ水解探針并釋放出靶分子和熒光信號(hào)。靶分子繼續(xù)和過量的熒光核酸探針雜交，使EXOⅢ繼續(xù)水解釋放靶分子和熒光信號(hào)，這樣熒光信號(hào)得到顯著放大，建立了基于EXOⅢ輔助的循環(huán)信號(hào)放大的DNA檢測(cè)體系。與傳統(tǒng)的分子信標(biāo)方法相比，該方法靈敏度更高，熒光信號(hào)放大能力更為顯著。此外，將雙熒光標(biāo)記的熒光探針混合，能夠通過熒光檢測(cè)信號(hào)的不同對(duì)基因 SNP進(jìn)行快速分型。近年來(lái)，越來(lái)越多的核酸探針應(yīng)

3、用于識(shí)別和捕獲檢測(cè)癌細(xì)胞，用于癌癥的早期診斷和治療。核酸適配體是一種單鏈DNA/RNA探針，類似抗體，能夠作為分子探針廣泛應(yīng)用于分子生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
　　本研究基于瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)，結(jié)合基于細(xì)胞的指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（Cell-SELEX），對(duì)完整的靶細(xì)胞進(jìn)行核酸適體篩選。以急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60為靶細(xì)胞，將靶細(xì)胞固定于瓊脂糖凝膠中，通過電泳過程中ssDNA與靶細(xì)胞的親和力不同而導(dǎo)致的電泳遷移率不同，分離出強(qiáng)特異