預(yù)處理對(duì)酶解過(guò)程中膠原ACE抑制肽釋放影響研究.pdf

1、膠原蛋白三螺旋區(qū)域含有豐富的ACE抑制活性肽段，然而膠原三螺旋區(qū)異常穩(wěn)定，不易被金屬基質(zhì)蛋白酶以外的蛋白酶降解，為暴露出更多酶切位點(diǎn)，促進(jìn)ACE抑制肽段在普通蛋白酶作用下快速釋放，在膠原蛋白水解前通常需進(jìn)行預(yù)處理。目前尚無(wú)專門針對(duì)預(yù)處理促進(jìn)膠原ACE抑制肽快速釋放的研究報(bào)道。本研究旨在探究出一種簡(jiǎn)單易行且可高效制備膠原ACE抑制肽的預(yù)處理方式，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。試驗(yàn)研究了酸、堿、熱、超聲、超高壓5種預(yù)處理方式單獨(dú)作用與超聲和酸

2、堿協(xié)同作用對(duì)膠原ACE抑制肽釋放的影響，并對(duì)水解液中ACE抑制肽進(jìn)行分離純化與序列鑒定。
　　以無(wú)處理組為對(duì)照，采用酸、堿、熱、超聲、超高壓預(yù)處理膠原蛋白，隨后進(jìn)行酶解，對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)水解液的水解度、ACE抑制率和分子量分布及預(yù)處理后膠原蛋白的熱穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種預(yù)處理方式對(duì)膠原蛋白的水解均有促進(jìn)作用，而對(duì)ACE抑制率的影響因處理方式而異，其中超聲處理、堿處理組水解液ACE抑制活性高且ACE抑制肽段釋放速率快。

3、結(jié)合酶解液多肽分子量分布及預(yù)處理后豬皮膠原的DSC、FIRT結(jié)果得出，堿處理破壞了膠原的非共價(jià)鍵平衡，改變了膠原構(gòu)象特點(diǎn)，其螺旋區(qū)域的酶切位點(diǎn)被充分暴露，經(jīng)蛋白酶解后可得到更多源于螺旋區(qū)域的ACE抑制肽;超聲處理破壞了膠原中部分共價(jià)交聯(lián)，使多肽鏈伸展或內(nèi)部疏水性基團(tuán)外露，暴露出更多疏水性位點(diǎn)，有利于堿性蛋白酶的酶解;其他處理方式破壞的可能大多是膠原非螺旋區(qū)，對(duì)膠原三螺旋區(qū)域酶切位點(diǎn)的暴露促進(jìn)程度有限。
　　基于前期的研究，將超聲與

4、酸堿處理相結(jié)合對(duì)膠原進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示超聲協(xié)同酸堿預(yù)處理較前期各預(yù)處理方式更有利于膠原ACE抑制肽的快速釋放，酶解1min時(shí)二者ACE抑制率均達(dá)88％以上，高于前期各處理方式酶解4h的水平，比較發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同堿較超聲協(xié)同酸處理組ACE抑制肽釋放速率更快。結(jié)合分子量分布及DSC、紅外光譜結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，超聲協(xié)同酸處理更多破壞了膠原分子間的共價(jià)交聯(lián)，而超聲協(xié)同堿主要破壞了維系三螺旋構(gòu)象的氫鍵進(jìn)而改變膠原亞基分子的構(gòu)象，對(duì)共價(jià)鍵影響不大，且后

5、者對(duì)三螺旋區(qū)酶切位點(diǎn)的暴露較前者更為明顯。掃描電鏡結(jié)果顯示，堿液可破壞膠原蛋白，但破壞僅限于膠原蛋白表面，在超聲協(xié)同堿的作用下，膠原蛋白形成了小顆粒，這可能增大了膠原的比表面積，使之暴露出更多酶切位點(diǎn)，有利于酶解進(jìn)行。
　　采用SephadexG-15、半制備高效液相色譜對(duì)超聲協(xié)同堿處理酶解30min的樣品進(jìn)行分離純化，純化后的樣品進(jìn)行序列鑒定。其中SephadexG-15分離膠原ACE抑制肽的最佳分離條件為:樣品濃度100mg/

6、mL;上樣量2mL;流速2mL/min;洗脫劑為蒸餾水;層析柱為1m×10mm的層析柱。在該分離條件下，混合肽被分成AP-Ⅰ、AP-Ⅱ兩個(gè)組分，IC50值分別為19.501、1.005mg/mL。對(duì)抑制活性較強(qiáng)的AP-Ⅱ進(jìn)一步采用半制備高效液相色譜進(jìn)行分離，其最佳分離條件為柱溫30℃，進(jìn)樣43.5μL（濃度10mg/mL），流速4.35mL/min，采用10％乙腈(含0.05％TFA)等度洗脫40min。半制備后得到8個(gè)組分峰，其中峰5