超聲預處理影響金槍魚皮膠原ACE抑制肽釋放機制及其酶解液消化穩(wěn)定性的研究.pdf

1、金槍魚是一種重要的經濟魚類，在全世界有很高的漁獲量，因口感細膩、營養(yǎng)豐富深受消費者的喜愛。金槍魚加工過程往往會產生占總重50~70％左右的下腳料，這些下腳料一般加工為飼料或魚餌，經濟價值不高，還會造成一定的環(huán)境污染。金槍魚皮含有豐富的膠原蛋白，三螺旋區(qū)域富含Pro和Hyp，是制備ACE抑制肽的良好來源。但膠原蛋白的三螺旋結構非常穩(wěn)定，除金屬基質蛋白酶外，其他蛋白酶很難接觸到膠原蛋白核心部位并釋放多肽，通常需要對原料進行適當的預處理以松散

2、三螺旋結構，暴露出內部酶切位點，促進三螺旋區(qū)活性肽段的釋放。傳統(tǒng)的預處理方式為酸、堿處理，但操作復雜且污染嚴重，超聲作為一種綠色能源可用于原料預處理。本文主要研究超聲預處理對金槍魚皮膠原ACE抑制肽釋放的影響機制，并對水解液胃腸消化特性以及其中高ACE抑制活性多肽的一級結構進行研究。
　　以金槍魚皮為原料，酶解液的DH和Hyp含量為指標，對膠原蛋白三螺旋區(qū)肽段釋放的超聲預處理工藝進行優(yōu)化，結果表明超聲時間為20 min、超聲功率為

3、30%（195 W）、料液比為1：15時為最優(yōu)預處理條件，該條件下酶解液DH為14.89%， Hyp含量為0.046 g。與未處理組相比，超聲處理組DH和Hyp含量有顯著提高（P＜0.05），表明超聲預處理促進了酶解過程的進行，同時促進了膠原三螺旋區(qū)多肽的釋放。通過FTIR分析比較超聲預處理前后的金槍魚皮結構，結果表明超聲破壞了膠原蛋白構象，從而促進了膠原三螺旋區(qū)多肽的釋放，促進了酶解過程的進行。通過HPLC分析兩組酶解液中10 kDa

4、以下小分子多肽分布情況，結果表明超聲預處理組小分子含量為88.67%，未處理組為46.39%，說明超聲預處理組酶解液中含有大量來源于三螺旋區(qū)的小分子肽段。
　　為明確超聲預處理對金槍魚皮酶解過程ACE抑制肽釋放的影響，對不同預處理條件下酶解過程中酶解液的DH、ACE抑制率及分子量分布進行測定，并通過DSC和FTIR分析超聲預處理前后金槍魚皮膠原蛋白熱穩(wěn)定性及膠原蛋白結構變化。酶解過程酶解液DH、ACE抑制率測定結果表明，超聲預處理

5、對魚皮膠原蛋白結構有一定的破壞作用，可改變酶解模式，在酶解5min時，酶解液DH與未處理組有顯著差異（P＜0.05），且ACE抑制率均高于未處理組，說明超聲可促進短時酶解過程中膠原三螺旋區(qū)ACE抑制肽的快速釋放。SDS-PAGE、HPLC分析組分分子量變化情況的結果表明，隨著酶解的進行，10 kDa以上大分子組分含量呈往復增減的變化規(guī)律，超聲預處理可加速這一過程的進行，從而提高ACE抑制肽的釋放效率。DSC結果表明，1~20 min的超

6、聲預處理可導致魚皮膠原熱變性溫度降低，與5 min酶解后，對應酶解液具有高ACE抑制率的結果一致，說明1~20 min的超聲預處理一定程度上破壞了膠原構象，可提高ACE抑制肽的釋放效率；但40 min的超聲預處理導致魚皮熱變性溫度升高，可能是因為長時間的超聲處理促使大量組分溶出并快速被降解，未溶出的膠原主體穩(wěn)定性反而得到加強，造成熱穩(wěn)定性有所增加。FTIR結果表明，超聲預處理破壞了膠原蛋白內部與N-H相關的氫鍵平衡，減少了維持三螺旋構象

7、的分子間和分子內締結氫鍵，減少蛋白結構中與C=O相關的氫鍵作用，進而松散了膠原三螺旋結構，同時造成膠原中α螺旋、β折疊含量減少，無規(guī)則卷曲、β轉角含量增加，使膠原結構向無序化轉變。這些變化可使更多的三螺旋區(qū)酶切位點暴露，在酶解過程中可以促進ACE抑制肽的快速釋放。
　　為驗證酶解液是否可在體內發(fā)揮ACE抑制活性，通過體外模擬消化實驗研究胃腸消化對酶解液ACE抑制活性的影響。結果表明各組消化液經過腸胃模擬消化后ACE抑制活性均有所提

8、高，且其中含有大量分子量低于3 kDa的小分子多肽，易于被小腸上皮細胞吸收，并發(fā)揮其ACE抑制活性功效；其中超聲預處理20min和40 min組的5 min酶解液效果最為明顯，選取以上兩組酶解液對其中高ACE抑制活性多肽進行進一步分離鑒定。首先用E5U20的樣品對SephadexG-15分離樣品的條件進行篩選，結果表明層析柱為1 m×10 mm，洗脫速度為0.5 mL/min，洗脫劑為蒸餾水的洗脫條件較好，兩組樣品均可分離為三個組分，其