環(huán)糊精修飾的樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒用于基因傳遞的研究.pdf

1、基因治療作為一種現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合而誕生的新技術(shù)，是通過(guò)將外源正?；?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)，用以糾正或補(bǔ)償基因缺失或異常引起的疾病，從而進(jìn)行疾病治療。然而，目前基因治療最主要的障礙就是缺乏一種安全有效的傳遞表達(dá)載體。在基因載體系統(tǒng)中，主要借助病毒和非病毒載體將外源基因?qū)氚屑?xì)胞。病毒載體由于其高效的轉(zhuǎn)染效率而被應(yīng)用于臨床上的基因治療，但由于發(fā)現(xiàn)了其很多安全隱患因此進(jìn)一步的廣泛應(yīng)用受到了制約。而非病毒載體，由于其低細(xì)胞毒性、無(wú)免疫原性、易

2、操作和高基因裝載量等特點(diǎn)，越來(lái)越受到研究者們的關(guān)注。
　　非病毒載體中，PAMAM聚酰胺胺樹(shù)狀大分子是目前研究最深入的樹(shù)狀大分子之一，它在保有樹(shù)狀大分子共性的同時(shí)又兼具自身的特性，因而受到了研究者們的廣泛關(guān)注。研究表明，PAMAM樹(shù)狀大分子的基因轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞毒性會(huì)隨著其代數(shù)的增加而增加。第一至四代的PAMAM毒性比較小，但基因轉(zhuǎn)染率卻很低；第五代以上的PAMAM大分子毒性較大，但基因轉(zhuǎn)染效率明顯提高。而第五代（G5）PAMAM樹(shù)

3、狀大分子雖然有一定的毒性，但可以通過(guò)進(jìn)行表面修飾以減少表面的氨基基團(tuán)數(shù)目，從而降低表面毒性，同時(shí)又保有較好的轉(zhuǎn)染能力。因此G5 PAMAM樹(shù)狀大分子已經(jīng)作為非病毒載體應(yīng)用于基因傳遞，然而其高細(xì)胞毒性與低基因轉(zhuǎn)染效率限制了其在基因治療方面的應(yīng)用。
　　為了提高其作為基因傳遞載體的性能，我們先將β-環(huán)糊精（β-CD）修飾到G5 PAMAM樹(shù)狀大分子表面，然后將其作為模板以1:25的樹(shù)狀大分子/金鹽摩爾比包裹金納米顆粒。在本課題的研究中

4、，我們通過(guò)核磁共振氫譜（1HNMR），紫外可見(jiàn)光譜（UV-vis）和透射電子顯微鏡（TEM）表征了所合成的β-CD修飾的樹(shù)狀大分子包裹納米金顆粒復(fù)合物（Au DENPs-β-CD）的物化性能；使用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、Zeta電勢(shì)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)測(cè)定Au DENPs-β-CD復(fù)合物在不同N/P比下對(duì)基因的壓縮能力；材料的生物相容性則使用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)試。隨后則用兩種不同的報(bào)告pDNA（熒光酶Luc基因和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白EGFP基因）以及兩種

5、不同siRNA（B淋巴細(xì)胞瘤-2基因Bcl-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF）分別在293T細(xì)胞和惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞內(nèi)驗(yàn)證材料作為載體應(yīng)用在傳遞基因方面的能力。
　　結(jié)果顯示Au DENPs-β-CD可以在低N/P時(shí)完全包裹pDNA（N/P=0.5時(shí)）及siRNA（N/P=2時(shí)），與未修飾β-CD的Au DENPs相比顯現(xiàn)出較低的細(xì)胞毒性與高效的基因傳遞效率。因其優(yōu)越的基因壓縮能力、低細(xì)胞毒性及高基因轉(zhuǎn)染效率，我們期待Au