豬繁殖與呼吸綜合征病毒激流式生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)研究.pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）又稱藍(lán)耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒引起的一種高度接觸性傳染病，主要以母豬繁殖障礙和生長豬及仔豬呼吸道疾病為特征，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，因此疫苗免疫是預(yù)防該病的主要手段。豬繁殖與呼吸綜合征病毒滅活疫苗已納為國家招標(biāo)疫苗，市場需求量大，但目前商品化的滅活疫苗成本高，且傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)工藝不僅費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、占地空間大，更重要的是病毒滴度不穩(wěn)定，批間病毒效價(jià)差異大。伴隨科技經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們的防疫意識越來越

2、強(qiáng)烈，因而對疫苗的依賴也越來越強(qiáng)，由此不管是人用疫苗還是獸用疫苗的市場都因此得到快速的發(fā)展，同樣疫苗的生產(chǎn)技術(shù)也將由傳統(tǒng)的方瓶培養(yǎng)、扁瓶培養(yǎng)、轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)轉(zhuǎn)向新型的生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)轉(zhuǎn)變。由原來的手工作坊生產(chǎn)、小規(guī)模生產(chǎn)轉(zhuǎn)向大規(guī)模培養(yǎng)。這種工藝轉(zhuǎn)變是國際生物制藥發(fā)展的必然趨勢，同時(shí)也表明我國疫苗生產(chǎn)技術(shù)在不斷的改進(jìn)和提升，甚至可以和國際疫苗生產(chǎn)技術(shù)媲美。反應(yīng)器細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用不僅僅是生產(chǎn)工藝得到改善，更重要的是疫苗的質(zhì)量也得到很大的提

3、高。這種先進(jìn)、省時(shí)、可操作性強(qiáng)的反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)將會(huì)得到我國各疫苗企業(yè)的青睞并進(jìn)一步得到廣泛的引進(jìn)和應(yīng)用。并逐步使我國由疫苗進(jìn)口轉(zhuǎn)變?yōu)橐呙绯隹诘拇髧?br>　　 本研究旨在:(1)優(yōu)化Marc-145細(xì)胞的培養(yǎng)條件和PRRSV在Marc-145細(xì)胞上增殖的最優(yōu)條件;(2)激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模增殖PRRSV技術(shù)優(yōu)化。
　　 1.利用方瓶培養(yǎng)Marc-145細(xì)胞，從細(xì)胞的不同凍存復(fù)蘇方法、培養(yǎng)基種類（高糖DMEM、低糖DMEM、

4、MEM）、溫度（35℃、37℃或39℃）、pH(6.8、7.2或7.4)、傳代比例（1∶3、1∶4或1∶5）等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，換液法復(fù)蘇Marc-145細(xì)胞后生長快、形態(tài)好，高糖DMEM培養(yǎng)基加10％新生牛血清、pH7.2、1∶3-1∶4的比例傳代、37℃、培養(yǎng)后120h可收獲最大細(xì)胞量(1.24×106個(gè))，最高糖耗量為1.62g/L。利用方瓶對PRRSV的增值進(jìn)行優(yōu)化。通過不同感染比(MOI)（0.02、0.04、0.0

5、8、0.16、0.24和0.30）、收毒時(shí)間(24h、48h、60h和72h)、pH（6.7、7.3和7.6）、接毒時(shí)間（24h、48h、72h和96h）、血清濃度（0％、2％、5％和8％）等培養(yǎng)條件對PRRSV增殖進(jìn)行比較試驗(yàn)。結(jié)果表明，PRRSV在Marc-145細(xì)胞上培養(yǎng)，在以下條件可獲較高毒價(jià):MOI=0.04、pH7.3、含2％血清的維持液(10mL)培養(yǎng)72h，可獲得較高毒價(jià)(105.5TCID50/0.1mL)。
　

6、　 2.利用激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模增殖PRRSV。通過不同細(xì)胞接入量(1×109、2×109和3×109個(gè))、pH（7.2-7.4或7.4-7.6）、溫度(36.5℃和39℃)、MOI(0.04或0.16)，DO值（20-40％、40-60％或70-80％）、循環(huán)流量(200、300、400或500mL/min)和振蕩頻率（40rpm、60rpm或80rpm）等培養(yǎng)條件以及流加培養(yǎng)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，在細(xì)胞接入量2-3×109、培養(yǎng)5