激流式生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)IBDV及制備高效滅活疫苗的研究.pdf

1、雞傳染性法氏囊病(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBD)是由IBD病毒(IBDV)引起的雞和火雞的一種急性、高度接觸性、免疫抑制性傳染病。該病自20世紀(jì)80年代傳入我國，至今仍是危害最為嚴(yán)重的禽病之一。目前，該病主要通過疫苗接種來防控。除給雛雞使用活疫苗免疫外，通常還給種雞注射滅活疫苗使雛雞獲得高的母源抗體，以保護(hù)其在生命早期不感染傳染性法氏囊病病。國內(nèi)雞傳染性法氏囊病滅活疫苗通常是采用雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)病毒

2、制備而成，免疫效果差，在生產(chǎn)中應(yīng)用效果不好。目前，國內(nèi)各大種雞場大多采用進(jìn)口滅活疫苗。近年來，生物反應(yīng)器大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)逐漸用于獸用生物制品。但目前對IBDV的研究不多，國內(nèi)也有利用Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器上增殖IBDV的報(bào)道，但是，沒能得到應(yīng)用。根據(jù)研究雞傳染性法氏囊病高效滅活疫苗的需要，本研究采用雞胚源DF-1細(xì)胞系，通過生物反應(yīng)器中微載體懸浮培養(yǎng)，獲得比傳統(tǒng)培養(yǎng)方法提高100倍的高效價(jià)病毒抗原，并用其成功研制了一種優(yōu)質(zhì)、高效的法氏囊

3、滅活疫苗，以滿足市場的需要。研究結(jié)果如下：
　　 1根據(jù)高效培養(yǎng)IBDV對于病毒滴度檢測的需要，針對雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP4基因的保守序列設(shè)計(jì)并合成了一對引物，以所構(gòu)建的重組質(zhì)粒作為陽性標(biāo)準(zhǔn)品，成功建立了檢測IBDV核酸載量的SYBRGreenⅠ熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)方法。應(yīng)用該方法和經(jīng)典TCID50方法初步對IBDV在方瓶中增殖動(dòng)態(tài)的測定結(jié)果表明，兩種方法測定的方瓶DF-1細(xì)胞中IBDV的增殖曲線

4、具有一定的平行關(guān)系，但QRT-PCR方法(4h)比TCID50方法(3-4d)更快速和敏感。
　　 2應(yīng)用所建立的QRT-PCR方法首次對微載體轉(zhuǎn)管微型反應(yīng)器和AP10生物反應(yīng)器培養(yǎng)的DF-1細(xì)胞中IBDV的增殖特性進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，并與經(jīng)典的TCID50測定法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明：①轉(zhuǎn)管(內(nèi)置0.6g紙片載體)中接種3×107個(gè)DF-1細(xì)胞，培養(yǎng)144h細(xì)胞可增至最大值2.4～2.5×108個(gè)，為最佳接毒時(shí)間；最佳接毒劑量

5、為0.79MOI，最佳收毒時(shí)間為接毒后的28h；上清和全懸液毒價(jià)呈平行關(guān)系，但后者更高，可達(dá)9.5(-1gTCID50/mL)以上(為轉(zhuǎn)瓶毒價(jià)的10倍)。②轉(zhuǎn)管中細(xì)胞數(shù)增長與糖耗間呈明顯平行關(guān)系，在細(xì)胞生長期內(nèi)(144h)平均每個(gè)細(xì)胞耗糖量為6.5×10-10g/24h，可根據(jù)糖耗量推測細(xì)胞生長狀態(tài)和數(shù)量；接毒后糖耗速率的高峰要先于病毒滴度的高峰，在糖耗高峰出現(xiàn)后下降至趨于零的瞬間收獲，可獲得較高毒價(jià)的病毒液。③在轉(zhuǎn)管培養(yǎng)毒價(jià)高峰時(shí)收獲

6、1/3毒液后9h，收獲1/2毒液后18h可再次獲得最高毒價(jià)的毒液；④反應(yīng)器中接毒劑量為1.05MOI時(shí)，接毒后24h最高毒價(jià)達(dá)到9.5(-1gTCID50/mL)；1/2換液后8h最高毒價(jià)只達(dá)到9.25(-1gTCID50/mL)。⑤反應(yīng)器中糖耗高峰比毒價(jià)高峰早，在耗糖量下降為0的左右病毒毒價(jià)達(dá)到高峰，但是毒價(jià)高峰與接毒時(shí)的細(xì)胞數(shù)和接毒劑量有關(guān)。⑥熒光定量測定的高密度培養(yǎng)條件下IBDV毒價(jià)的上升和下降趨勢及高峰的時(shí)間與FCID50測定結(jié)

7、果基本一致，但熒光定量方法更快速和敏感。
　　 3用IBDV細(xì)胞毒HQ株在雞胚源DF-1細(xì)胞系上連續(xù)傳10代，并對10代內(nèi)的細(xì)胞毒液分別進(jìn)行了病毒含量測定及免疫原性、特異性、保存期和純凈性的鑒定，證明在10代內(nèi)HQ株細(xì)胞毒的上述特性基本一致，從而建立了IBDVHQ株的生產(chǎn)種子批。將IBDVHQ株反應(yīng)器DF-1細(xì)胞培養(yǎng)液(109.5TCID50/mL)、轉(zhuǎn)瓶DF-1(108.5TCID50/mL，3倍濃縮)及CEF細(xì)胞培養(yǎng)液(10

8、7.5TCID50/mL，5倍濃縮)按試行規(guī)程制備滅活疫苗，并進(jìn)行各項(xiàng)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，其半成品及成品檢驗(yàn)(物理性狀檢驗(yàn)、無菌檢驗(yàn)、安全試驗(yàn))均符合規(guī)程要求。三種疫苗免疫原性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，DF-1細(xì)胞反應(yīng)器疫苗中和抗體明顯高于轉(zhuǎn)瓶苗，攻毒保護(hù)免疫組兩種DF-1疫苗都為100％保護(hù)，對照組保護(hù)率為0，CEF苗中和抗和攻毒保護(hù)都較DF-1苗低。
　　 本研究通過利用轉(zhuǎn)管載體微型反應(yīng)器進(jìn)行DF-1細(xì)胞高密度培養(yǎng)，在自動(dòng)控制的生物反應(yīng)器中