肝素化膠原-殼聚糖海綿的制備及評(píng)價(jià).pdf

1、燒燙傷是生活中常見的意外傷害。目前，臨床上多采用包扎療法處理燒燙傷創(chuàng)面。包扎療法中所用的創(chuàng)面敷料作為創(chuàng)面的臨時(shí)覆蓋物，在創(chuàng)面愈合過程中，它可以暫時(shí)替代皮膚起到保護(hù)作用，防止創(chuàng)面感染發(fā)炎，為創(chuàng)面愈合提供一個(gè)有利的環(huán)境。創(chuàng)面敷料根據(jù)敷料形式可以分為薄膜型敷料、水凝膠型敷料、噴霧型敷料和海綿型敷料。其中，海綿型敷料具有比較大的孔隙率，能夠吸收較多創(chuàng)面滲出液，并且具有較好的透氣性，不會(huì)造成創(chuàng)面滲出液的積聚。針對(duì)深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面滲出液較多的特點(diǎn)，本

2、課題選用海綿型敷料進(jìn)行研究。創(chuàng)面敷料的常用材料有膠原、殼聚糖、透明質(zhì)酸、海藻酸鹽等，本課題選擇生物大分子-膠原和殼聚糖為基材，并復(fù)合肝素研制海綿型敷料用于深Ⅱ度燒燙傷的創(chuàng)面愈合。
　　臨床研究證實(shí)肝素(Heparin)具有治療燒燙傷的作用。肝素促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的作用機(jī)制如下:肝素能夠改善創(chuàng)面微循環(huán)，有效防止血栓形成;還可以保護(hù)并協(xié)同機(jī)體在創(chuàng)傷局部分泌的表皮生長(zhǎng)因子(EGF)，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)發(fā)揮促愈合的作用;肝素還可以影響

3、膠原重建，肝素和膠原酶形成復(fù)合物，調(diào)控膠原纖維的重新排列，使膠原纖維排列更加整齊，使創(chuàng)面逐漸上皮化。雖然有肝素用于燒燙傷治療臨床實(shí)踐，但其應(yīng)用并未普及。因?yàn)楦嗡刈⑸浣o藥后在體內(nèi)的半衰期較短，需要頻繁給藥，而肝素全身高劑量給藥易發(fā)生出血，所以臨床上使用肝素治療燒燙傷以局部用藥的方式更佳。膠原(Collagen)是皮膚的主要成分。膠原作為生物大分子，具有良好的生物相容性、生物可降解性和弱抗原性，所以膠原在生物醫(yī)學(xué)材料和藥物緩釋領(lǐng)域中有著廣泛

4、的應(yīng)用。但是單一組分的膠原海綿機(jī)械強(qiáng)度較低，并且易降解，所以一般加入交聯(lián)劑或氨基聚糖增加膠原海綿的機(jī)械強(qiáng)度，調(diào)節(jié)膠原海綿的降解性。殼聚糖(Chitosan)是一種重要的組織工程生物材料，具有良好的生物相容性、抗菌活性、生物可降解性，被制作成人工皮膚和可降解手術(shù)縫合線等。大量研究證實(shí)，殼聚糖對(duì)細(xì)菌和真菌都具有抑制作用。尤其是對(duì)一些創(chuàng)面常見的細(xì)菌，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢桿菌的都具有明顯的抑菌作用。
　　本研究針對(duì)滲出液

5、多的深Ⅱ度感染創(chuàng)傷，設(shè)計(jì)了肝素化膠原/殼聚糖海綿。以膠原和殼聚糖這兩種材料為基材，使用EDC/NHS交聯(lián)劑復(fù)合肝素，制成了膠原和殼聚糖配比一定(w/w,2∶8)，二者的質(zhì)量總百分含量不同的肝素化膠原/殼聚糖海綿，并對(duì)總百分含量不同的海綿的理化性質(zhì)，包括表觀密度、孔隙率、吸水率、保濕性、溶失率等進(jìn)行了系統(tǒng)研究，篩選出理化性質(zhì)較優(yōu)海綿配方。通過測(cè)定抑菌圈的大小對(duì)篩選出的海綿的體外抑菌活性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，并對(duì)篩選出的海綿主要生物相容性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，

6、包括體外細(xì)胞毒性、急性全身毒性和溶血率。在此基礎(chǔ)上，利用大鼠全皮膚切層模型和豚鼠深Ⅱ度燙傷感染模型，對(duì)制備的肝素化膠原/殼聚糖海綿進(jìn)行了抗感染、促愈合作用及機(jī)制考察。本研究主要取得以下研究成果:
　　1.豬皮Ⅰ型膠原的制備及結(jié)構(gòu)確證。采用酸膨脹-胃蛋白酶降解法從豬皮中提取膠原，以SigmaⅠ型膠原標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照品，通過紫外光譜掃描、紅外光譜掃描、SDS-PAGE凝膠電泳以及羥脯氨酸含量測(cè)定等結(jié)構(gòu)確證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)提取的膠原為Ⅰ型膠原。<

7、br>　　2.膠原和殼聚糖總百分含量不同的肝素化膠原/殼聚糖海綿的制備及理化性質(zhì)研究。采用兩步凍干法制備肝素化膠原/殼聚糖海綿，首先制備膠原和殼聚糖配比一定(w/w,2∶8)，二者的總質(zhì)量百分含量不同（1.2％、2.4％和3.0％）的膠原/殼聚糖海綿;然后用EDC/NHS交聯(lián)劑復(fù)合肝素后再次凍干獲得肝素化膠原/殼聚糖海綿。評(píng)價(jià)了膠原和殼聚糖總百分含量不同的海綿的理化性質(zhì)，包括表觀密度、孔隙率、吸水率、保濕性、透氣率以及溶失率等，篩選出理

8、化性質(zhì)較為優(yōu)越的合適百分含量的海綿做進(jìn)一步研究。同時(shí)測(cè)定了膠原和殼聚糖總百分含量為2.4％的肝素化膠原/殼聚糖海綿（2.4％C-C-H海綿）中肝素的體外釋放曲線，證實(shí)了海綿敷料中的肝素能夠緩慢釋放，不存在突釋現(xiàn)象。
　　3.所研制海綿敷料的體外抑菌作用評(píng)價(jià)。選擇大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單孢桿菌這三種創(chuàng)面易感染的細(xì)菌為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)了自制海綿敷料體外抑菌作用。證實(shí)自制海綿敷料對(duì)這三種細(xì)菌均具有明顯的抑菌作用，而商品膠原海綿沒

9、有抑菌作用。
　　4.所研制海綿敷料的生物安全性考察。評(píng)價(jià)了膠原和殼聚糖總百分含量為2.4％的交聯(lián)膠原/殼聚糖海綿（2.4％C-C海綿）、2.4％C-C-H海綿和商品膠原海綿的部分相容性，包括體外細(xì)胞毒性、急性全身毒性和溶血率。結(jié)果表明自制的海綿敷料具有良好的生物安全性。
　　5.肝素化膠原/殼聚糖海綿對(duì)大鼠全皮膚缺損創(chuàng)面愈合的影響。在大鼠全皮膚切層模型造模14天時(shí)，拍照記錄創(chuàng)面輪廓，并利用Image J軟件計(jì)算創(chuàng)面愈合率，

10、然后取皮膚組織進(jìn)行HE染色和VEGE，EGF的免疫組化檢測(cè)。結(jié)果表明，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為85.5％、99.8％、98.3％和90.1％。HE結(jié)果表明，愈合效果最好的2.4％C-C海綿組，其次是商品膠原海綿組、2.4％C-C-H海綿組、紗布組。術(shù)后14天時(shí)VEGE和EGF的免疫組化結(jié)果表明，VEGF在各組創(chuàng)面組織中都有所表達(dá)，其中2.4％C-C-H海綿組為強(qiáng)陽(yáng)性(+++

11、)，商品膠原海綿組和2.4％C-C海綿組為中度陽(yáng)性(++)，紗布組為弱陽(yáng)性(+)。EGF在各組的創(chuàng)面組織中均有表達(dá)，商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面組織中EGF的量差別不明顯，均為中度陽(yáng)性，紗布組為弱陽(yáng)性。雖然在創(chuàng)面愈合后期2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面組織中VEGF和EGF的量比其他三組略多，該海綿能夠促進(jìn)創(chuàng)面愈合，但是在創(chuàng)面愈合初期該海綿中的肝素會(huì)抑制血小板的聚集和釋放，并且肝素具有抗炎活性，這兩

12、方面的作用會(huì)延遲創(chuàng)面愈合。所以在術(shù)后14天時(shí)，2.4％C-C-H海綿組中的大鼠創(chuàng)面愈合率略低于2.4％C-C海綿組中的大鼠創(chuàng)面愈合率。顯示在全皮膚缺損創(chuàng)面愈合中，2.4％C-C海綿效果更優(yōu)。
　　6.肝素化膠原/殼聚糖海綿對(duì)豚鼠深二度燒傷感染模型創(chuàng)面愈合的影響。分別于術(shù)后4、7天時(shí)，拍照記錄創(chuàng)面輪廓，并利用ImageJ軟件計(jì)算創(chuàng)面愈合率，并取皮膚組織進(jìn)行HE和免疫組化檢測(cè)。結(jié)果表明，術(shù)后4天，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C

13、海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為19.0％、23.6％、31.0％和34.0％。術(shù)后7天，紗布組、商品膠原海綿組、2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組的創(chuàng)面愈合率分別為36.9％、39.5％、41.2％和57.0％。HE染色結(jié)果表明，紗布組、商品膠原海綿組創(chuàng)面有大量的膿細(xì)胞和炎細(xì)胞，而2.4％C-C海綿組和2.4％C-C-H海綿組創(chuàng)面只有少量的膿細(xì)胞和炎細(xì)胞。愈合效果最好的2.4％C-C-H海綿組，其次是2.

14、4％C-C海綿組、商品膠原海綿組、紗布組。術(shù)后4天時(shí)，VEGE和EGF的免疫組化結(jié)果表明，VEGF在各組創(chuàng)面組織中都有所表達(dá)，其中2.4％C-C-H海綿組為中度陽(yáng)性(++)，其他三組為弱陽(yáng)性(+)。EGF在紗布組（-）的創(chuàng)面組織中沒有表達(dá)，而在其他三組的創(chuàng)面組織中均有所表達(dá)。并且EGF在2.4％C-C-H海綿組(+++)的創(chuàng)面組織中的量高于2.4％C-C海綿組(++)和商品膠原海綿組(++)。這表明，2.4％C-C-H海綿組對(duì)于豚鼠深Ⅱ