基于巰基化殼聚糖季銨鹽納米粒及膠原支架的基因遞釋研究.pdf

1、1.巰基化殼聚糖季銨鹽(TMC-Cys)用于pDNA的體內(nèi)外轉(zhuǎn)染以及機(jī)理研究
　　我們結(jié)合了殼聚糖季銨鹽(TMC)和巰基化殼聚糖的優(yōu)點(diǎn)，設(shè)計(jì)合成了巰基化殼聚糖季銨鹽(TMC-Cys)作為新型的非病毒基因給藥載體。不同分子量(30，100 and200kDa)和季銨化程度(15％and30％)的TMC-Cys通過(guò)聚電解質(zhì)法與表達(dá)綠色熒光蛋白的pEGFP質(zhì)粒形成自組裝納米復(fù)合物(nanocomplex，NC)。毒性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示在濃度

2、小于2mg/ml時(shí)聚合物均未顯示出細(xì)胞毒性。EB排阻實(shí)驗(yàn)和凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)顯示TMC-Cys可以有效的縮合pDNA，在適合的N/P比條件下，形成平均粒徑在120nm-200nm、zeta電勢(shì)為+15mV-+20mV的納米粒。TMC-Cys/pEGFP NC表現(xiàn)出很好的物理穩(wěn)定性并且可以保護(hù)pEGFP免受核酶的降解。TMC-Cys/pEGFPNC的紅細(xì)胞粘附率比TMC/pEGFPNC高2.7倍，粘蛋白粘附率TMC/pEGFPNC高1.5倍，H

3、EK293細(xì)胞的攝取率比TMC/pEGFPNC高2.6倍，比Lipofectamine2000高3倍。將培養(yǎng)溫度從37℃降至4℃可以使TMC-Cys/pEGFP NC的HEK293細(xì)胞攝取率降低3/4，而疊氮化鈉的預(yù)處理也可以使TMC-Cys/pEGFP NC的HEK293細(xì)胞攝取率降低1/3，表明TMC-Cys/pEGFP NC的HEK293細(xì)胞攝取是一個(gè)依賴代謝熱量的過(guò)程。用氯丙嗪預(yù)處理可以使TMC-Cys/pEGFP NC的HEK

4、293細(xì)胞攝取率降低70％，暗示了TMC-Cys/pEGFP NC是通過(guò)網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式入胞。胞內(nèi)高濃度的還原性谷胱甘肽使得TMC-Cys/pEGFP NC以比胞外快3.5倍的速度釋放pEGFP，使得核質(zhì)內(nèi)的pEGFP濃度迅速增加。共聚焦激光顯微鏡的定量定性實(shí)驗(yàn)都表明TMC-Cys/pEGFP NC釋放pEGFP入核的濃度比TMC/pEGFP NC高3.7倍。正因?yàn)樯鲜鲞@些理由，TMC-Cys/pEGFP NC在HEK293細(xì)胞中

5、的轉(zhuǎn)染效率比TMC/pEGFP NC高1.4-3.2倍，其中適合的TMC-Cys(100，30)/pEGFP NC的轉(zhuǎn)染效率比Lipofectamine2000高1.5倍。在小鼠后腿腓腸肌中注射納米復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)也證明TMC-Cys(100，30)/pEGFP NC的體內(nèi)轉(zhuǎn)染效率比TMC/pEGFP NC高2.3倍，比Lipofectamine2000高4.1倍。
　　2.載有TMC-Cys/pDNA NC的3D膠原支架用于皮膚增生

6、性瘢痕治療的初步研究
　　增生性瘢痕通常是皮膚受損后創(chuàng)口愈合異常產(chǎn)生的結(jié)果，通常表現(xiàn)為皮膚和皮下組織中細(xì)胞外基質(zhì)尤其是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的過(guò)度沉積。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGFβ1)在皮膚纖維化病變中扮演著重要的角色。Smad蛋白是細(xì)胞內(nèi)TGFβ1通路的重要信號(hào)傳導(dǎo)分子，參與調(diào)節(jié)膠原的合成。因此我們用TMC-Cys和表達(dá)smad2 siRNA的pSUPER質(zhì)粒組裝成納米復(fù)合物，載入凍干法制備的多孔膠原支架中，用于抑制TGFβ1信號(hào)通路

7、的活性。多孔膠原支架提供了三維的支持空間，包封率在60％以上并受載藥量的控制，在體外表現(xiàn)出持續(xù)的釋放特性，第三天累積釋放量達(dá)到70％左右。阿爾瑪蘭細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)顯示皮膚成纖維細(xì)胞可以在其中良好的生長(zhǎng)繁殖，7天內(nèi)細(xì)胞數(shù)量可以擴(kuò)增一倍。RT-PCR的結(jié)果顯示載有TMC-Cys/pSUPER-smad2 NC的膠原支架可以有效的抑制生長(zhǎng)于其中的皮膚成纖維細(xì)胞中smad2、Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的mRNA表達(dá)，抑制效率達(dá)到80-87％。酶聯(lián)免疫