馬克斯克魯維酵母菊粉酶基因在Aureobasidium melanogenum P10菌株中的表達(dá)和油脂的生產(chǎn).pdf

1、隨著化石能源的快速消耗和人們對(duì)環(huán)境問(wèn)題的日益重視，研究者逐漸將注意力轉(zhuǎn)移到可再生能源上。生物柴油具有生產(chǎn)周期短、燃燒性能好和可再生等優(yōu)點(diǎn)，是化石能源的良好替代品。目前，生物柴油工業(yè)主要以動(dòng)植物油脂作為原料進(jìn)行生物柴油的生產(chǎn)。與動(dòng)植物油脂相比，利用微生物油脂生產(chǎn)生物柴油具有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。產(chǎn)黑色素短梗霉（Aureobasidium melanogenum）是一類細(xì)胞形態(tài)類似酵母的真菌。之前的研究發(fā)現(xiàn)，A.melanogenumP10菌株（

2、以下簡(jiǎn)稱P10菌株）在特定條件下培養(yǎng)時(shí)胞內(nèi)油脂含量達(dá)菌體干重的66.3％。以P10菌株胞內(nèi)油脂為原料制備的生物柴油燃燒情況良好。分析發(fā)現(xiàn)A.melanogenum基因組DNA中沒(méi)有編碼菊粉酶的基因。A.melanogenum菊粉酶活力很低，為了使P10菌株能有效地轉(zhuǎn)化菊粉生產(chǎn)油脂，非常有必要在該菌株高效超表達(dá)菊粉酶基因。
　　本研究以潮霉素B抗性基因?yàn)闃?biāo)記基因構(gòu)建了A.melanogenum表達(dá)載體pAPX13。并在P10菌株中成

3、功地表達(dá)了馬克斯克魯維酵母（Kluyveromycesmarxianus）菊粉酶基因（INU1）。篩選到一株高產(chǎn)菊粉酶的轉(zhuǎn)化子API41（以下簡(jiǎn)稱API41菌株），菊粉酶酶活達(dá)到28.5 U/mL，與P10菌株的菊粉酶酶活相比提高了275％。重組菊粉酶最適反應(yīng)溫度為60℃，在溫度不高于50℃時(shí)保持較高活性;最適反應(yīng)pH為4.5，在pH3.0-7.0之間能夠保持65％以上活性。
　　在搖瓶中以濃度為8％的菊粉為碳源培養(yǎng)API41菌株

4、和P10菌株。培養(yǎng)結(jié)束后，API41菌株和P10菌株生物量分別為12.92 g/L和9.96 g/L;胞內(nèi)油脂含量分別占菌體干重的59.67％(w/w)和53.71％(w/w)。API41菌株培養(yǎng)液中的總糖殘余量為2.1 g/L，P10菌株培養(yǎng)液中的總糖殘余量為13.4 g/L。以濃度為8％的菊粉為碳源在10-L發(fā)酵罐中培養(yǎng)API41菌株生產(chǎn)油脂，發(fā)酵結(jié)束后，API41菌株生物量達(dá)到14.38 g/L，胞內(nèi)油脂含量為菌體干重的66.20

5、％(w/w)，油脂產(chǎn)量是0.12 g/g，菌體產(chǎn)量是0.18 g/g，生產(chǎn)強(qiáng)度是0.001 g/g/h。
　　分別將API41菌株和P10菌株生產(chǎn)的油脂進(jìn)行甲酯化，用氣相色譜法分析脂肪酸組成。結(jié)果顯示，API41菌株和P10菌株胞內(nèi)油脂成分相同，棕櫚酸(C16∶0)、亞油酸(C18∶2)和油酸(C18∶1)占脂肪酸總量的95％以上。以API41菌株發(fā)酵生產(chǎn)的胞內(nèi)油脂為原料用酸催化法制備生物柴油，在催化反應(yīng)時(shí)間為25 min時(shí)生物柴