類鼻疽桿菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)蛋白BPSS1395的重組表達(dá)及生物學(xué)活性研究.pdf

1、目的:
　　類鼻疽伯克霍爾德菌（Burkholderia pseudomallei，B.pseudomallei，簡稱類鼻疽桿菌）作為一種正在擴(kuò)散的人獸共患傳染病病原菌，能夠?qū)е路Q為類鼻疽(melioidosis)的熱帶醫(yī)學(xué)疾病，病死率高達(dá)40％。由于類鼻疽桿菌可在人體潛伏數(shù)十年后發(fā)病，故類鼻疽也被稱為“不定時炸彈”。
　　細(xì)菌分泌系統(tǒng)在其致病中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，包括Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type threesecretion sy

2、stem，T3SS)。BPSS1395基因定位于類鼻疽桿菌的T3SS，目前功能未知。通過生物信息學(xué)和BLAST比對發(fā)現(xiàn)與之同源性較高的蛋白是青枯桿菌的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子HrpF(hypersentive response and pathogenicity F)，屬于其T3SS效應(yīng)蛋白。我們推測BPSS1395可能是類鼻疽桿菌T3SS的轉(zhuǎn)運(yùn)和定向元件。因此，本研究擬通過基因工程技術(shù)重組表達(dá)具有生物活性的BPSS1395蛋白并制備其抗體，確

3、定其亞細(xì)胞定位;同時，構(gòu)建類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除株，通過感染番茄植株證實(shí)BPSS1395在類鼻疽桿菌感染植物中的重要作用。以上實(shí)驗(yàn)將為深入研究類鼻疽桿菌作為一種潛在的植物病原造成人的感染和傳播作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用PCR擴(kuò)增類鼻疽桿菌BPSS1395基因，目的基因與pET-22b載體質(zhì)粒通過BamHⅠ/XhoⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)回收、連接后轉(zhuǎn)化Escherichia coli BL21(DE

4、3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽性重組子，經(jīng)雙酶切和DNA測序驗(yàn)證。
　　2.篩選得到的陽性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白并鑒定其表達(dá)形式，洗滌BPSS1395蛋白包涵體，通過復(fù)性得到可溶的BPSS1395蛋白。
　　3.以復(fù)性BPSS1395蛋白免疫家兔，制備抗BPSS1395血清;Western blot、ELISA及免疫熒光分析其免疫學(xué)性質(zhì)。
　　4.通過超速離心機(jī)分離全菌各組分，Western blot分析BPSS13

5、95蛋白的亞細(xì)胞定位。
　　5.利用同源重組技術(shù)構(gòu)建類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除菌株:PCR擴(kuò)增類鼻疽桿菌BPSS1395基因上下游同源臂，連接至pK18mobSacB自殺質(zhì)粒上，通過大腸桿菌S17-1λpir以接合方式將其轉(zhuǎn)入類鼻疽桿菌中，而后蔗糖篩選獲得基因敲除突變菌株，PCR、DNA測序鑒定敲除菌株。
　　6.類鼻疽桿菌野生株、BPSS1395基因敲除菌株和EHEC O157∶H7對照組分別感染番茄植株根部，觀察

6、植株及葉片的生長情況，PCR鑒定植物基因組中的細(xì)菌，電鏡觀察植株葉片病理學(xué)變化。
　　結(jié)果:
　　1.PCR獲得了全長870bp BPSS1395目的基因，構(gòu)建了表達(dá)重組質(zhì)粒的陽性工程菌pET-22b-BPSS1395/BL21(DE3)。
　　2.陽性工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，包涵體洗滌、復(fù)性獲得了分子量為32kDaBPSS1395重組蛋白。
　　3.該蛋白免疫家兔抗血清ELISA效價達(dá)1∶1280000，并能

7、與目的蛋白及類鼻疽桿菌全菌發(fā)生特異性抗原抗體反應(yīng)。
　　4.BPSS1395蛋白在類鼻疽桿菌中主要定位于細(xì)胞質(zhì)。
　　5.成功構(gòu)建了類鼻疽桿菌BPSS1395基因敲除突變菌株。
　　6.類鼻疽桿菌野生株和BPSS1395基因敲除株分別感染番茄植株后，雖然野生株與敲除株感染后葉片未見明顯變化，但是電鏡觀察發(fā)現(xiàn)野生型感染組植物葉片的組織結(jié)構(gòu)中有類鼻疽桿菌存在，同時PCR擴(kuò)增出特異性類鼻疽桿菌基因，而敲除株感染組沒有。