基于鈣影像的甜味感應(yīng)細胞模型建立及應(yīng)用.pdf

1、人工甜味劑是一類能賦予食品甜味的添加劑，并被廣泛運用于食品等加工領(lǐng)域，近年來，對人工甜味劑安全性質(zhì)疑的研究不斷，然而對于人工甜味劑對機體的影響機制還尚不明確。而對其甜度的評價也一直依賴于人的感官品評，仍然沒有較直接的評價方法。由于品評人員個體、生活環(huán)境和閱歷等生理和心理的差異，對甜度客觀、真實感受的表達存在很大的制約性。人工甜味劑因其不提供或提供極低熱量在食品加工業(yè)中流行起來，因此，建立一種簡單客觀的甜度評價方法極為重要。
　　甜

2、味感應(yīng)細胞是指能夠表達甜味受體蛋白且能夠識別甜味打開下游信號通路的細胞。近十幾年來，有不少研究指出了人工甜味劑與甜味受體結(jié)合，引起胞內(nèi)甜味信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子Ca2+濃度的變化。本文正是從甜味劑甜度和味覺感受基礎(chǔ)的角度，以甜味感應(yīng)細胞作為研究對象，利用鈣影像的方法建立甜味感應(yīng)細胞模型NCI-H716細胞，對其暴露甜度12的人工甜味劑sucralose，通過qPCR，Western blot等實驗技術(shù)觀察T1R2/T1R3在mRNA水平和蛋白水平

3、的表達情況，基于甜味受體表達量變化的基礎(chǔ)，通過鈣影像技術(shù)觀察人工甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+釋放與T1R2/T1R3表達量相關(guān)性，人工甜味劑甜度，甜味受體表達量與甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值是否成絕對的正相關(guān)性，從而初步探究基于甜味感應(yīng)細胞鈣影像的甜度檢測方法。同時深入探討了人工甜味劑影響機體健康的機制。
　　本課題旨在研究人工甜味劑甜度，甜味感應(yīng)細胞T1R2/T1R3表達量以及甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值三者之間的相關(guān)性

4、。結(jié)果如下:
　　(1)甜味感應(yīng)細胞模型的建立
　　對HEK-293細胞瞬時表達甜味受體，通過qPCR的方式在基因水平對蛋白表達進行鑒定，成功構(gòu)建了瞬時表達甜味受體的HEK-293細胞（HEK-293T），另外用甜度600的sucralose同時刺激STC-1、NCI-H716和HEK-293T細胞，比較刺激引起的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值，最終確定NCI-H716細胞為最佳的甜味感應(yīng)細胞模型。
　　(2)人工甜味劑長期暴

5、露促進甜味感應(yīng)細胞甜味受體蛋白表達量
　　在本實驗室前期小鼠sucralose甜度偏好研究的基礎(chǔ)上，選擇甜度6和12的sucralose作為NCI-H716細胞的暴露甜度，甜度12的sucralose能夠更好的促進甜味受體蛋白表達。隨后，用甜度12的sucralose暴露NCI-H716細胞，通過qPCR和western blot技術(shù)分別對暴露前后的mRNA水平和蛋白表達水平進行鑒定，發(fā)現(xiàn)均有較顯著的增強表達?？芍?，甜度12的su

6、cralose長期暴露NCI-H716細胞，可以誘導(dǎo)甜味受體蛋白表達量的增加。
　　(3)甜味受體蛋白表達量的增加促進人工甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量增加
　　基于sucralose誘導(dǎo)的NCI-H716細胞甜味受體蛋白表達量增加，同等刺激條件下，胞內(nèi)Ca2+濃度增量隨著甜味受體蛋白表達量增加而增加。在不同甜度AK和sucralosre刺激NCI-H716細胞，發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+濃度增量與人工甜味劑甜度呈正相關(guān)性，而等甜度

7、的AK和sucralose同樣條件下刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量不一致。
　　(4) sucralose（一定甜度范圍內(nèi)）可用甜味劑刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值來評估甜度。
　　通過計算單位受體單位甜度AK和sucralose刺激的胞內(nèi)Ca2+濃度增量值，發(fā)現(xiàn)，sucralose在甜度200-600之間，單位受體單位甜度刺激引起的胞內(nèi)Ca2+增量值(AUC)是一致的，將這個值作為一個常數(shù)(K)，可得到甜度等于單位受體單位甜度刺