NC1-H716細(xì)胞作為甜味感受熱力學(xué)模型細(xì)胞的研究.pdf

1、甜味感受是甜味劑分子刺激味蕾細(xì)胞而產(chǎn)生的一種復(fù)雜的物理、化學(xué)和生理過程，是人們最喜好且最感興趣的一種基本味感，但是關(guān)于味細(xì)胞感受甜味的確切機(jī)理還尚在探索中。過去基于細(xì)胞水平的甜味感受機(jī)理研究方法主要包括鈣影像和電生理。而近些年了發(fā)展起來的高靈敏度的等溫量熱滴定技術(shù)，為我們從熱力學(xué)角度詮釋甜味感受機(jī)制提供了新的思路。但是要實(shí)現(xiàn)細(xì)胞水平上甜味感受的熱力學(xué)研究需要有穩(wěn)定的表達(dá)甜味受體蛋白的細(xì)胞來源?；诒緦?shí)驗(yàn)室前期建立的一種高效分離純化小鼠Ⅱ

2、型味蕾細(xì)胞方法，在數(shù)量上難于滿足甜味感受熱力學(xué)研究的需要，因此尋找一種可以替代味蕾細(xì)胞，并能滿足甜味感受需求的模型細(xì)胞對于詮釋甜味感受的熱力學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。
　　 立于此本研究尋找了一種味蕾細(xì)胞的替代細(xì)胞——NCI-H716，并從受體、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子及功能角度證明此種細(xì)胞具有感受甜味味蕾細(xì)胞的功能。進(jìn)一步以NCI-H716細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，我們建立了甜味感受熱力學(xué)研究的等溫滴定微量實(shí)驗(yàn)條件及數(shù)據(jù)處理方法，最后初步用模型細(xì)胞進(jìn)行甜味感

3、受熱力學(xué)研究，充分表明NCI-H716細(xì)胞可以作為甜味感受熱力學(xué)研究的模型細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　 (1)NCI-H716細(xì)胞作為甜味感受味蕾細(xì)胞代替細(xì)胞的確定。通過免疫組化、免疫熒光和RT-PCR及鈣影像技術(shù)，從甜味受體、下游信號(hào)傳導(dǎo)及功能角度證明了NCI-H716作為味蕾細(xì)胞代替細(xì)胞的可行性。免疫及逆轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果表明該細(xì)胞表達(dá)了有用于甜味感受信號(hào)傳導(dǎo)因子(G蛋白α-gustducin、磷脂酶C)及甜味感受蛋白(T1R2、

4、T1R3)，而鈣影像實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，此細(xì)胞能夠與甜味物質(zhì)相互作用。
　　 (2)以NCI-H716細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，確定了甜味物質(zhì)與細(xì)胞等溫量熱滴定條件及建立了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理方法。通過對緩沖液，溫度以及正/反滴定條件的探討，確定了適合NCI-H716細(xì)胞的甜味感覺微量熱研究的實(shí)驗(yàn)參數(shù)：緩沖液，10mM HEPEs;溫度，310.15K;滴定模式，正向滴定模式。由于不能用等溫滴定量熱儀的自帶軟件對實(shí)驗(yàn)滴定結(jié)果進(jìn)行分析，因此通過目前的實(shí)驗(yàn)

5、建立了適合模型細(xì)胞甜味感覺微量熱實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)處理方法，即扣除甜味劑稀釋熱和比較相互作用總熱量方法。
　　 (3)利用NCI-7H16細(xì)胞進(jìn)行甜味感受熱力學(xué)的初步研究，包括對不同濃度的蔗糖溶液區(qū)分，與九種常見甜味劑相互作用的微量熱實(shí)驗(yàn)，并且與味蕾細(xì)胞同甜味劑的熱力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，NCI-7H16細(xì)胞能夠良好區(qū)分不同濃度的蔗糖溶液；與味蕾細(xì)胞同甜味劑相互作用相比，NCI-7H16細(xì)胞可以獲得更好的熱力學(xué)曲線；而且與九種甜味