蛋白支架多酶組裝合成谷胱甘肽的研究.pdf

1、谷胱甘肽是一種含有巰基的小分子肽類物質(zhì)，具有抗氧化、抗病毒、增強機體免疫力等多種生理功能，在醫(yī)藥、化妝品和食品行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。本文以提高體外多酶催化合成谷胱甘肽效率為目標(biāo)，將錨定區(qū)域(Dockerin domain)引入谷胱甘肽雙功能酶GshF，實現(xiàn)ATP再生的ADK酶和PAP酶，在大腸桿菌中重組表達(dá)，經(jīng)親和層析純化后與蛋白支架進(jìn)行組裝，用于催化合成谷胱甘肽。
　　克隆獲得錨定區(qū)域基因和谷胱甘肽雙功能酶GshF、ADK和PAP

2、基因，通過酶切連接后整合到pET-28a(+)載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET28a(+)-GshF-Doc1-1,pET28a(+)-PAP-Doc1-3,pET28a(+)-ADK-DocⅡ。另外，從嗜纖維梭菌基因組DNA PCR擴增獲得將含有對應(yīng)粘連區(qū)域(cohesin)的Coh1-1、CohⅡ和CBD-Coh1-3基因，連接到pET-Duet1載體，構(gòu)建重組表達(dá)載體pETDuet-1-Coh1-1-CohⅡ-CBD-Coh1-3。<

3、br>　　以E.coli BL21(DE3)作為表達(dá)宿主，優(yōu)化重組蛋白GshF-Doc1-1的表達(dá)條件。結(jié)果表明:培養(yǎng)宿主菌至其對數(shù)生長中期，培養(yǎng)溫度設(shè)置為28℃，加入最終濃度為0.2mmol/L的IPTG誘導(dǎo)， GshF-Doc1-1的最高酶活力可達(dá)2332U/L。對重組表達(dá)蛋白進(jìn)行Ni-NTA親和層析純化，純化后GshF-Doc1-1的比酶活達(dá)13.24U/mg，是粗酶的13.4倍，酶活收率達(dá)到76％。開展了GshF-Doc1-1酶

4、學(xué)特性研究，GshF-Doc1-1催化反應(yīng)的最適溫度為37℃，最適pH為8.5，催化反應(yīng)最適的ATP和Mg2+濃度分別為10mmol/L和30mmol/L，過量的ATP對酶催化反應(yīng)有一定的抑制作用。
　　重組菌E.coli BL21(DE3)/ pET28a(+)-ADK-DocⅡ經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，利用Ni柱親和層析純化，純化后的ADK-DocⅡ比酶活達(dá)2.8U/mg。利用ADK-DocⅡ催化ADP生成ATP，反應(yīng)平衡后A

5、TP∶ADP=1∶1.32，ADP的轉(zhuǎn)化率達(dá)到42.4％，反應(yīng)最佳pH為8.0，最適溫度為40℃。
　　重組菌E.coli BL21(DE3)/pET28a(+)-PAP-Doc1-3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的產(chǎn)物，利用Ni柱親和層析純化，純化后的PAP-Doc1-3比酶活達(dá)2.3U/mg。利用PAP-Doc1-3催化AMP生成ADP，反應(yīng)平衡后AMP∶ADP=1∶1.52，ADP的轉(zhuǎn)化率達(dá)到70.2％。反應(yīng)最佳pH為8.5，最適溫度為

6、50℃。
　　最后，將GshF-Doc1-1、ADK-DocⅡ、 PAP-Doc1-3固定在蛋白支架上，用于催化合成谷胱甘肽，在加入終濃度為5mmol/L ATP和5mmol/L polyP條件下，經(jīng)過3小時的反應(yīng)，GSH的最終產(chǎn)量可達(dá)5.6mmol/L，比未采用蛋白支架組裝多酶合成谷胱甘肽的產(chǎn)量提高了25％左右。此過程中相當(dāng)于消耗了11.2mmol/LATP，表明ATP再生效率約為2。多酶催化體系反應(yīng)的最適反應(yīng)溫度為37℃，最適