谷胱甘肽合成相關(guān)酶在重金屬污染生物修復(fù)中的分子機(jī)制及比較研究.pdf

1、隨著社會經(jīng)濟(jì)和工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染成為全球范圍內(nèi)關(guān)注的環(huán)境問題。這種污染不僅會影響動(dòng)植物生長發(fā)育、導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量下降，并且通過食物鏈直接威脅人類身體健康。因而，解決重金屬污染問題迫在眉睫。生物修復(fù)(Bioremediation)技術(shù)由于其高效、經(jīng)濟(jì)、綠色、清潔、環(huán)保等特點(diǎn)，作為污染生態(tài)學(xué)的一個(gè)重要課題，在重金屬污染治理中逐漸引起人們的關(guān)注。天然存在的具備重金屬生物修復(fù)作用的微生物和超累積植物等往往由于它們在重金屬逆境中的生長緩慢、生物

2、量小等弊端，常常會影響生物修復(fù)的效率。本研究采用基因工程遺傳轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)基模擬、轉(zhuǎn)基因抗性微生物及植物篩選等技術(shù)手段，針對利用谷胱甘肽合成相關(guān)酶來提高大腸桿菌和能源甜菜生物修復(fù)重金屬污染效果展開實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地摸索了三種谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶的重金屬逆境中的響應(yīng)機(jī)制，以及它們在轉(zhuǎn)基因大腸桿菌、擬南芥和能源甜菜體內(nèi)的表達(dá)特性;比較研究了三種基因型的重組大腸桿菌和轉(zhuǎn)基因植物在重金屬逆境下的表現(xiàn)型、生理生化差異及對重金屬Cd、Zn、Cu的吸收規(guī)律;比較

3、驗(yàn)證了這三種谷胱甘肽合成相關(guān)酶對提高大腸桿菌微生物、擬南芥、能源甜菜的重金屬耐受性和重金屬離子生物富集量的作用;初步探索了重組大腸桿菌和重金屬耐性轉(zhuǎn)基因植物在重金屬生物修復(fù)方面的作用，從而為生物修復(fù)品種的開發(fā)提供了新思路。本研究的主要內(nèi)容包括以下幾方面:
　　1.利用RT-PCR技術(shù)，本研究分別克隆了擬南芥(Arabidopsis thaliana L.)中編碼谷胱甘肽合成酶的γ-GCS和GS的AtGCS（Genbank acce

4、ssion no.NM_118439）、AtGS（Genbank accession no.NM_122620）基因以及嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus）中編碼谷胱甘肽合成酶StECS-GS的StECS-GS(Genbank accession no.GQ848551)基因。這三個(gè)基因CDS全長分別為1569 bp、1620 bp、2265 bp;所編碼蛋白的分子量分別為58.56 kDa、60.27 kD

5、a、85.12 kDa;等電點(diǎn)分別為6.52、6.45和4.9;根據(jù)PSORT軟件預(yù)測，三個(gè)蛋白在植物體內(nèi)分別有56％、94％和45％的可能性位于過氧化物酶體、葉綠體膜以及細(xì)胞質(zhì)中;同時(shí)在AtGCS和AtGS的5'非翻譯區(qū)域存在著與干旱等環(huán)境逆境相關(guān)的順式作用元件，說明它們可能與環(huán)境逆境之間存在著一定的應(yīng)答關(guān)系。
　　2.系統(tǒng)地比較研究了擬南芥AtGCS和AtGS基因在Cd、Zn、Cu重金屬逆境下的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性。研究結(jié)果表明這兩個(gè)

6、基因均在轉(zhuǎn)錄水平上受到200μM Cd2+、Zn2+、Cu2+重金屬逆境的誘導(dǎo)，并且與對照相比，它們在擬南芥地上部和地下部中表達(dá)量均有所增加。但在不同處理時(shí)間下受重金屬逆境脅迫的影響，AtGCS和AtGS基因的表達(dá)量也出現(xiàn)了一定的變化和差異。在Cd逆境中，擬南芥地上部AtGS的誘導(dǎo)表達(dá)比較突出，而在地下部，AtGCS的誘導(dǎo)表達(dá)更明顯一些;在Zn和Cu逆境下，AtGCS對前者的響應(yīng)更加明顯一些，AtGS則對后者更為敏感;在重金屬方面，Cd

7、對兩個(gè)基因的誘導(dǎo)表達(dá)量的增幅最大，并且在Cd逆境下，兩個(gè)基因在地上部的表達(dá)量要高于地下部，Zn和Cu逆境在這方面的差異不大。這說明擬南芥AtGCS和AtGS基因與重金屬環(huán)境逆境之間存在著一定的應(yīng)答關(guān)系，并且它們可能分別不同程度地參與到了擬南芥的抗重金屬生理活動(dòng)中。
　　3.利用大腸桿菌外源蛋白重組技術(shù)，系統(tǒng)地比較了分別大量表達(dá)重組蛋白TrxA-AtGCS、TrxA-AtGS、TrxA-StECS-GS的重組大腸桿菌，在1 mM C

8、dCl2、ZnCl2、CuCl2重金屬脅迫下的重金屬耐受性和重金屬離子富集能力。研究結(jié)果表明，過量表達(dá)TrxA的對照菌株在1mM重金屬逆境下生長受到了嚴(yán)重的抑制，而過量表達(dá)TrxA-StECS-GS的E.coli對重金屬逆境的耐受性最強(qiáng)，并且在提高細(xì)胞的存活率方面表現(xiàn)出StECS-GS＞AtGCS＞ AtGS的趨勢;同時(shí)，在重金屬逆境下，重組菌的重金屬富集能力也與對照相比具有明顯的優(yōu)勢:過量表達(dá)TrxA-StECS-GS的E.coli對

9、Cd、Zn、Cu的富集量分別是對照的15倍、8倍、9倍左右;TrxA-AtGCS過量表達(dá)細(xì)胞提高了10倍、5倍、7倍的大腸桿菌對重金屬離子富集量;而過量表達(dá)TrxA-AtGS的大腸桿菌稍差一些，分別是對照的5、4、5倍左右。重組菌體內(nèi)的GSH含量趨勢(TrxA-StECS-GS＞TrxA-AtGCS＞TrxA-AtGS＞ TrxA)可以解釋這種重金屬高富集量的現(xiàn)象和差異。同時(shí)，研究將另外兩種在重金屬抗性機(jī)制中發(fā)揮重要作用的功能蛋白OsH

10、SP90和OsCATb作為對比研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)GST-OsHSP90和GST-OsCATb的重組大腸桿菌盡管在生長勢方面比過量表達(dá)GST的對照菌株高，并介于TrxA-AtGCS和TrxA-AtGS之間，但是它們的重金屬富集能力和體內(nèi)GSH含量卻沒有明顯提升。這說明谷胱甘肽合成相關(guān)酶、分子伴侶和抗氧化酶在重金屬抗性機(jī)制方面有所不同，并且在行使重金屬污染生物修復(fù)功能方面，谷胱甘肽合成相關(guān)酶具有更加明顯的優(yōu)勢。其中，StECS-GS的作

11、用最為突出。
　　4.利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將AtGCS、AtGS以及StECS-GS基因遺傳轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，以比較研究它們在植物體內(nèi)的重金屬耐受能力和在重金屬生物修復(fù)中的潛力和分子機(jī)制。研究結(jié)果表明，在正常生長條件下，分別過量表達(dá)AtGCS、AtGS以及StECS-GS目的基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥株系（gcs2、gs2和ecs-gs4）和野生型（wt）在生長狀態(tài)上沒有明顯差異;而隨著CdCl2、ZnCl2、CuCl2的重金屬濃度的增

12、加，wt的生長受到了嚴(yán)重的抑制，并在根長及鮮重方面僅為ecs-gs4的1/4-1/3左右;過量表達(dá)AtGCS、AtGS以及StECS-GS的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在Cd和Cu中均不同程度的提高了重金屬耐受性，其中StECS-GS的作用最大;而在Zn逆境下，只有StECS-GS轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出重金屬耐受性的提高。在重金屬離子富集量方面，總體表現(xiàn)出轉(zhuǎn)基因植株地上部的重金屬累積量高于地下部，轉(zhuǎn)基因植株之間表現(xiàn)出StECS-GS基因型＞AtGCS、A

13、tGS基因型＞野生型累積趨勢，并且ecs-gs4對Cd的富集量最高，是對照的4.5倍以上，Zn和Cu稍低一些。而在GSH和PC的含量上，總體趨勢也同樣呈現(xiàn)出類似的現(xiàn)象，并且隨著逆境的施加，GSH在總體水平上下降，而PC含量上升。以上結(jié)果表明了三個(gè)谷胱甘肽合成關(guān)鍵酶在重金屬逆境下是通過自身的過量表達(dá)解除相應(yīng)的反饋抑制從而大量催化合成了GSH和PC，而GSH和PC可以大量螯合重金屬離子，并具備抗氧化功能，因而使得轉(zhuǎn)基因擬南芥可以表現(xiàn)出對重金

14、屬離子的高度富集和耐受性。而StECS-GS因其具備的雙重谷胱甘肽合成酶功能，在抗重金屬逆境方面的獨(dú)特優(yōu)勢使其成為利用基因工程培育人工超累積植物的優(yōu)勢基因，在重金屬植物修復(fù)中具有潛在的優(yōu)勢。
　　5.以上述研究為基礎(chǔ)，以可以生產(chǎn)生物燃料乙醇的能源甜菜為生物修復(fù)基礎(chǔ)材料，通過模擬實(shí)驗(yàn)研究了StECS-GS基因在提高轉(zhuǎn)基因甜菜對單一或復(fù)合重金屬Cd、Zn、Cu污染的耐受性和生物富集量方面的作用，初步探討了該基因在能源甜菜體內(nèi)的重金屬響

15、應(yīng)機(jī)制和規(guī)律。研究結(jié)果表明過量表達(dá)StECS-GS基因的轉(zhuǎn)基因甜菜(s2、s4、s5)，在不同濃度(50、100、200μM Cd、Zn、Cu)重金屬逆境脅迫下，它們與對照植株wt相比均表現(xiàn)出明顯的生長優(yōu)勢，并且在鮮重和根長方面得以具體體現(xiàn);這種生長優(yōu)勢基本上與StECS-GS基因的表達(dá)量成正比。同時(shí)，在植株葉片葉綠素含量方面，重金屬逆境下轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的含量也比野生型植株有所提升，但轉(zhuǎn)基因植株之間差異不大。在100μM重金屬離子強(qiáng)度下

16、，轉(zhuǎn)基因植株s2、s4、s5地上部(Shoot)中的Cd、Zn、Cu的重金屬累積量分別是對照甜菜的5倍至4倍左右，并且表現(xiàn)出s2＞s4＞s5＞wt的趨勢;在根中，轉(zhuǎn)基因植株s2重金屬的累積量要小于s4、s5，但卻是對照植株2-3倍左右。總體來說，轉(zhuǎn)基因植株地上部重金屬離子的累積量是地下部的三倍以上，甚至更多。這說明在轉(zhuǎn)基因甜菜體內(nèi)對于重金屬離子的累積主要集中在地上部。在正常生長條件下，轉(zhuǎn)基因植株s2、s4和s5體內(nèi)GSH的含量分別是wt

17、對照甜菜的5倍、4倍和3.8倍左右，這說明StECS-GS的過量表達(dá)催化合成了大量的GSH;而在Cd、Zn、Cu脅迫下，s2、s4、s5和wt體內(nèi)的GSH含量有所下降，PC含量上升，轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的GSH和PC含量始終高于對照。因而，轉(zhuǎn)基因植株所表現(xiàn)的高重金屬耐受性和高重金屬離子富集能力的現(xiàn)象基本可以解釋為GSH一部分用于合成PC并與其一起螯合重金屬離子，另一部分可能在抗重金屬氧化脅迫中發(fā)揮重要作用。在雙重Cd-Zn、Cd-Cu、Zn-