花生紅衣原青素的分離鑒定及其對(duì)丙烯酰胺抑制作用的研究.pdf

1、自2002年發(fā)現(xiàn)經(jīng)高溫加熱或油炸的食品中存在準(zhǔn)致癌物-丙烯酰胺（AM）以來，人們開始廣泛地關(guān)注這一問題產(chǎn)生的原因以及如何控制食品加工過程中AM的產(chǎn)生。從食品加工過程中AM產(chǎn)生的機(jī)理入手，尋求抑制AM生成的辦法，是廣大學(xué)者們所熱衷研究的內(nèi)容?，F(xiàn)有研究證實(shí)通過添加食品添加劑可以有效控制食品加工過程中AM的產(chǎn)生，包括添加酸度調(diào)節(jié)劑、氨基酸或者蛋白質(zhì)、維生素等皆可以減少高溫加熱或油炸食品中AM的含量，最新研究證實(shí)生物黃酮類化合物是一種更值得關(guān)注

2、的AM抑制劑，抑制機(jī)理主要?dú)w結(jié)于其結(jié)構(gòu)中存在活性強(qiáng)的酚羥基。原花青素作為一種富含多個(gè)活性酚羥基的黃烷醇，已有文獻(xiàn)證實(shí)其可能是一種新型、高效的影響食品加工過程中AM產(chǎn)生的抑制劑。但是由于原花青素結(jié)構(gòu)復(fù)雜（有A型和B型兩種結(jié)構(gòu)，有多種聚合度），其量效關(guān)系、構(gòu)效關(guān)系如何，還遠(yuǎn)未被揭示清楚。本研究以富含A型和B型低聚體原花青素的花生紅衣作為研究材料，對(duì)其中的原花青素進(jìn)行分離和鑒定;與此同時(shí)，建立可穩(wěn)定產(chǎn)生AM的模擬體系以及可準(zhǔn)確、靈敏檢測(cè)所產(chǎn)生

3、的AM的分析方法;在此基礎(chǔ)上研究不同結(jié)構(gòu)花生紅衣原花青素對(duì)AM的抑制效果。主要研究?jī)?nèi)容和研究結(jié)果如下:
　　1.花生紅衣中原花青素的提取、分離和鑒定。采用70％乙醇溶液提取花生紅衣中的原花青素，通過AB-8大孔樹脂純化并采用正丁醇-鹽酸法測(cè)定花生紅衣原花青素混合物(PSP)的純度，通過ToyopearlHW-40凝膠色譜，甲醇作為流動(dòng)相，將PSP進(jìn)行分離，利用RP-HPLC-MS/MS對(duì)凝膠分離級(jí)分進(jìn)行進(jìn)一步分離和鑒定。經(jīng)AB-8

4、樹脂純化后原花青素混合物的純度大于98.0％，得率為9.8％。凝膠色譜將PSP分離成PSP-1～PSP-8，即8個(gè)含有不同分子質(zhì)量大小或構(gòu)型的原花青素級(jí)分。通過RP-HPLC-MS/MS分析技術(shù)對(duì)其中的6個(gè)級(jí)分進(jìn)行分析，結(jié)果表明:PSP-1是以兒茶素或者表兒茶素為結(jié)構(gòu)單元的黃烷醇單體，PSP-2由2種B型原花青素二聚體組成，PSP-3主要是由4種B型原花青素二聚體構(gòu)成，PSP-4是由4種A型原花青素二聚體組成，PSP-5是具有原花青素單

5、體、A型原花青素二聚體與三聚體的混合物，PSP-6主要是由2種A型原花青素三聚體形成。
　　2.AM的HPLC-DAD分析方法的建立。選用Hypercarb色譜柱，檢測(cè)波長(zhǎng):205nm，進(jìn)樣量:10μL，流動(dòng)相為純水，柱溫為40℃，流速:0.6mL/min，運(yùn)行時(shí)間:15min。并分別考察了精密度、穩(wěn)定性、定量限和檢出限。精密度與穩(wěn)定性的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5.0％，說明該方法準(zhǔn)確度與穩(wěn)定性均較高;根據(jù)信噪比(S/N)分別為3

6、和10時(shí)，確定其檢出限為0.05μg/mL、定量限為0.10μg/mL。AM線性范圍為0.5μg/mL-5.0μg/mL時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=145366x-16907(R2=0.9983);線性范圍為5.0μg/mL-30.0μg/mL時(shí)，則AM標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為y=144914x+4517.5(R2=0.9999)。
　　3.建立化學(xué)模擬體系中AM提取及SPE富集方法。通過比較HyperSepRetainPEP和OasisHLB

7、兩種SPE柱的富集效果和回收率，選用OasisHLB柱進(jìn)行SPE分離。AM屬于極性物質(zhì)，易溶于水和有機(jī)溶劑中，分別比較了甲醇，乙腈，乙酸乙酯，0.1mol/L、pH6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)化學(xué)模擬體系中的AM提取效果，通過所建立的HPLC-DAD分析方法，并結(jié)合回收率分析發(fā)現(xiàn):PBS對(duì)化學(xué)模擬體系中的AM提取效果最好，其回收率達(dá)到74.75％-105.00％。
　　4.優(yōu)化并確立了天冬酰胺和葡萄糖在高溫下反應(yīng)生成AM的反應(yīng)

8、體系。在等摩爾(0.5∶0.5)的天冬酰胺和葡萄糖參與反應(yīng)的前提下，分別考察PBS體積、加熱時(shí)間、加熱溫度三個(gè)因素對(duì)AM生成的影響，天冬酰胺和葡萄糖模擬產(chǎn)生AM量最大的條件為:PBS的添加量為1.5mL、反應(yīng)溫度175℃，加熱40min。
　　5.不同PSP級(jí)分對(duì)AM抑制效果的比較。研究了PSP-1對(duì)AM抑制效果的量效關(guān)系，分別比較了0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、1.5mg/mLPSP-1對(duì)AM產(chǎn)生的抑制效

9、果，當(dāng)PSP-1濃度為0.5mg/mL時(shí)，其抑制率為54.4％達(dá)到最高。在此基礎(chǔ)上下，分別比較了PSP-1、PSP-2、PSP-3、PSP-4、PSP-5、PSP-6對(duì)AM的抑制效果，發(fā)現(xiàn)PSP-1（兒茶素和/或表兒茶素）、PSP-2（B型原花青素二聚體）、PSP-4(A型原花青素二聚體)、PSP-5（原花青素單體、A型原花青素二聚體與三聚體的混合物）的抑制率均在50.0％左右，PSP-3（B型原花青素二聚體）的抑制率達(dá)到了74.3％，