斜帶石斑魚TLR1、TLR2和MyD88基因的克隆與免疫應(yīng)答研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLR)為Ⅰ型跨膜蛋白,其識(shí)別病原相關(guān)分子模式后,通過依賴MyD88(Myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)或TRIF(TIRdomain-containingadaptor-inducinginterferon-β,TRIF)信號(hào)傳導(dǎo)通路,誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和干擾素調(diào)節(jié)因子的表達(dá),啟動(dòng)固有免疫和適應(yīng)性免疫而抵御病原入侵。在魚類中至少發(fā)現(xiàn)了17

2、種類型的TLR,其分子結(jié)構(gòu)和功能有一些不同于哺乳動(dòng)物的特征。斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)是我國南方沿海地區(qū)一個(gè)重要的養(yǎng)殖品種,其高密度養(yǎng)殖導(dǎo)致各種病害頻頻發(fā)生,給斜帶石斑魚養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。為了解斜帶石斑魚的免疫系統(tǒng),本研究運(yùn)用RT-PCR和RACE-PCR技術(shù)克隆了斜帶石斑魚TLR1(EcTLR1)、EcTLR2和EcMyD88基因全長cDNA,應(yīng)用生物信息學(xué)方法解析了這些基因的結(jié)構(gòu)與功能,通過實(shí)時(shí)定量

3、PCR的方法分析其在正常魚體組織中的表達(dá)模式,以及PolyⅠ:C、細(xì)菌LPS和溶藻弧菌刺激后的應(yīng)答規(guī)律。
　　 EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88cDNA全長分別為3195bp、3439bp和1795bp;預(yù)測其開放閱讀框分別為2406bp、2466bp和870bp,分別編碼801、821和289個(gè)aa;其5'UTR分別為240bp、378bp和243bp,3'UTR分別為549bp、595bp和682bp。3'UTR均

4、有多聚腺苷酸加尾信號(hào)序列AATAAA。EcMyD883'UTR存在兩個(gè)mRNA不穩(wěn)定基序ATTTA。
　　 為預(yù)測功能結(jié)構(gòu)域,應(yīng)用SMART程序分析蛋白結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示,EcTLR1和EcTLR2蛋白胞外區(qū)分別存在9個(gè)和10個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)基序,胞內(nèi)區(qū)各有唯一的1個(gè)TIR結(jié)構(gòu)域;EcMyD88蛋白的N端和C端分別存在死亡結(jié)構(gòu)域和TIR結(jié)構(gòu)域。潛在功能位點(diǎn)預(yù)測TLR1蛋白擁有N糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位

5、點(diǎn)、N?；稽c(diǎn)和酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)5種功能基序。TLR2蛋白除有N糖基化位點(diǎn)、蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、N?；稽c(diǎn)外,還有依賴cAMP和cGMP蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)、細(xì)胞附著序列和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)。EcMyD88只有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)功能基序。
　　 序列比對(duì)分析顯示EcTLR1氨基酸序列與其它魚類的TLR1同一性為47.5-62.4％,與哺乳動(dòng)物和禽類TLR1的同一性分別為36-38.2％和36.2

6、-37.1％。EcTLR2氨基酸序列與其它魚類的TLR2同一性為46.3-74.8％,高于與哺乳動(dòng)物TLR2的同一性(39.7-40.7％)和禽類TLR2的同一性(39.1-40.1％)。EcMyD88氨基酸序列與其它魚類的同一性高(67-78.7％),與哺乳動(dòng)物和雞的MyD88同一性較低,分別為60.9-62.6％和57.1％。EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88的TIR結(jié)構(gòu)域與其它脊椎動(dòng)物的同一性為56.8％-89.8％。根據(jù)

7、TLR1、TLR2或MyD88氨基酸序列構(gòu)建的3個(gè)遺傳進(jìn)化樹,結(jié)果類似,進(jìn)化樹上的物種被分為魚類、禽類和哺乳動(dòng)物3支。EcTLR1、EcTLR2或EcMyD88同一性和進(jìn)化樹分析顯示斜帶石斑魚與其它魚類的遺傳關(guān)系親近。
　　 在所有組織中均檢測到EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88mRNA。EcTLR1和EcTLR2主要在脾臟、頭腎和胸腺中表達(dá),EcMyD88主要在肝臟、脾臟、頭腎和胸腺中表達(dá)。注射斜帶石斑魚LPS24h后

8、,脾臟和胸腺中的EcTLR1、EcTLR2、EcMyD88和EcIL-1βmRNA水平上調(diào)1.52-2.47倍。注射PolyⅠ:C24h后,頭腎、脾臟和胸腺中的EcTLR1、EcTLR2、EcMyD88和EcIL-1βmRNA水平上調(diào)1.52-3.64倍。腹腔注射溶藻弧菌后3-7d頭腎中的EcTLR1和EcTLR2mRNA轉(zhuǎn)錄上調(diào)1.59-2.57倍;脾臟中的EcTLR1和TLR2mRNA在感染溶藻弧菌后1d上升1.47和1.9倍;頭腎

9、和脾臟中的EcMyD88和EcIL-1β的mRNA在感染溶藻弧菌后1-7d均上升2-39.75倍。表明EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88參與了溶藻弧菌感染的免疫應(yīng)答。
　　 為制備抗EcMyD88的多克隆抗體,將EcMyD88編碼區(qū)克隆至pET-32a,構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a-EcMyD88,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21,在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)了EcMyD88。應(yīng)用His-Bind樹脂柱成功純化EcMyD88重組蛋白,