2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、背景:乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)是一種嗜肝DNA病毒,其感染仍是世界范圍內慢性肝炎、肝硬化、肝癌的主要成因,嚴重危害人類健康,而治療慢性乙型肝炎的首要目標是持久抑制病毒的復制。阿德福韋酯(Adefovir,ADV)是目前被批準治療慢性乙型肝炎的一種核苷類似物藥物,通過抑制HBV聚合酶(HBV Polymerase,HBV-Pol)的活性來抑制病毒復制,但是長期治療會發(fā)生耐藥導致治療失敗。
  HBV

2、聚合酶主要分成四個結構域:N末端蛋白區(qū)(TP),間隔區(qū)(SD),逆轉錄酶區(qū)(Reverse Transcriptase,RT),核糖核酸酶(RNaseH)區(qū)。該蛋白同時具有DNA聚合酶和RNaseH酶活性,直接參與了HBV基因組的復制。HBV繁殖速度快,但其DNA聚合酶缺乏糾錯能力,復制過程中有大量突變發(fā)生,使得藥物與HBV聚合酶的親和力下降,進而導致藥物抑制病毒復制的作用明顯減弱,其中HBV聚合酶RT區(qū)域的rtN236T和rtA181

3、T/V變異是與阿德福韋耐藥有關的常見變異位點[6,7]。臨床研究發(fā)現,一些患者在長期使用同一種抗病毒藥物治療過程中會發(fā)生病毒載量的“反跳”,先前的藥物已經不能抑制病毒的復制??梢娤惹坝盟幵斐傻耐蛔兡芨淖兒罄m(xù)的治療方案和治療效果。因此開展對HBV聚合酶RT區(qū)域功能的研究和對ADV等核苷類似物引起的耐藥進行實時監(jiān)測尤為必要。
  目的:本課題一方面擬通過表達純化HBV聚合酶RT區(qū)蛋白,來探索ADV抑制RT的機制;另一方面嘗試建立一種快

4、速、靈敏、特異檢測ADV耐藥突變株的方法,實現實時監(jiān)測ADV耐藥突變的發(fā)生,為后續(xù)治療方案的調整提供依據。
  方法:1:以臨床慢性乙肝患者血清中的HBV DNA為模板,克隆HBV聚合酶RT區(qū)到原核表達載體pHis-SUMO載體上,構建了重組表達質粒SUMO-RTWT,進一步通過定點突變構建含有阿德福韋耐藥突變位點(181T/V+236T)的原核表達質粒SUMO-MT1和SUMO-MT2,原核表達產物經SDS-PAGE及Weste

5、rn blot鑒定,并進行原核表達條件的優(yōu)化和HBV聚合酶RT區(qū)域的結構建模。2:利用反向雜交技術原理設計特異性肽核酸探針,通過氨基酸偶聯(lián)在尼龍膜基質上,通過一系列優(yōu)化實驗,包括探針濃度,雜交條件,洗脫條件等進行優(yōu)化,篩選出最佳反應條件,能特異性檢測常見的ADV耐藥突變位點;利用構建的含有ADV耐藥位點的標準質粒株完成方法學評價,同時通過臨床樣本對檢測指標(靈敏度、準確性和精確度)的評價。
  結果:通過分子克隆的技術,成功克隆、

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