“分子開關(guān)”在HBV基因拉米夫定耐藥突變檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、目的:研究硫化修飾引物和高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的分子開關(guān)在HBV基因拉米夫定常見耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)中的應(yīng)用。
　　方法:文獻(xiàn)資料顯示乙肝患者最為常見的耐藥突變位點(diǎn)主要集中于HBV基因的pol聚合酶基中一段500bp的核酸序列之內(nèi)。人工合成包含HBV基因所有常見藥物耐藥突變位點(diǎn)的核酸序列,并克隆至PUC57載體得到包含HBV基因所有常見耐藥突變位點(diǎn)的突變模板1(204位耐藥突變?yōu)閅VDD);通過重疊延伸PCR方法定點(diǎn)突變突變模板1的2

2、04位使其突變?yōu)?YIDD)并將得到的PCR片段克隆至PMD-19T載體測(cè)序鑒定得到包含HBV所有常見耐藥突變位點(diǎn)的突變模板2(204位耐藥突變?yōu)閅IDD);提取HBV患者血漿游離DNA并設(shè)計(jì)特定引物,擴(kuò)增得到野生型HBV基因片段,將其克隆至PMD19-T載體并經(jīng)測(cè)序鑒定得到野生模板。依據(jù)HBV基因序列設(shè)計(jì)針對(duì)M204V,M204I,L180M,V173L四個(gè)拉米夫定常見耐藥突變位點(diǎn)的突變檢測(cè)引物使其與突變模板配對(duì)而與野生模板不配對(duì)。對(duì)

3、于突變檢測(cè)引物在其3’端及次3’端進(jìn)行硫化修飾。以高保真DNA聚合酶及硫化修飾的引物所構(gòu)成的突變敏感分子開關(guān)分別對(duì)上述四個(gè)常見的耐藥突變位點(diǎn)進(jìn)行PCR檢測(cè)。比較突變敏感分子開關(guān)對(duì)突變模板及野生模板的“開”及“關(guān)”作用,并通過對(duì)普通PCR及熒光定量PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化,確定所建立的檢測(cè)平臺(tái)的檢測(cè)敏感度與檢測(cè)靈敏度。
　　結(jié)果:本課題成功建立了HBV基因拉米夫定四個(gè)常見藥物耐藥突變位點(diǎn)(M204V, M204I, V173L

4、, L180M)的分子開關(guān)的突變檢測(cè)平臺(tái)。分子開關(guān)對(duì)于配對(duì)的突變模板可擴(kuò)增出特異性產(chǎn)物,對(duì)于野生模板則無擴(kuò)增產(chǎn)物或僅在很高拷貝數(shù)時(shí)出現(xiàn)。將突變模板及野生模板以10倍為單位逐級(jí)稀釋,獲得質(zhì)?？截悢?shù)為107-101的不同濃度。本課題所建立的突變敏感分子開關(guān)檢測(cè)平臺(tái)對(duì)于M204V的檢測(cè)靈敏度達(dá)到100拷貝,特異性達(dá)到1000拷貝;對(duì)M204I檢測(cè)靈敏度達(dá)100拷貝,檢測(cè)特異性高達(dá)105拷貝;對(duì)L180M檢測(cè)靈敏度達(dá)10拷貝,檢測(cè)特異性達(dá)100

5、0拷貝,對(duì)V173L檢測(cè)靈敏度達(dá)10拷貝,檢測(cè)特異性達(dá)104拷貝。并且成功建立了HBV拉米夫定耐藥的多重PCR檢測(cè)平臺(tái)對(duì)上述四個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)其檢測(cè)靈敏度達(dá)100拷貝,檢測(cè)特異性達(dá)1000拷貝。
　　結(jié)論:高保真DNA聚合酶介導(dǎo)的突變敏感分子開關(guān),對(duì)已知突變的檢測(cè)有較高的靈敏度和特異性,可以檢測(cè)微量的突變,本課題所構(gòu)建的突變敏感分子開關(guān)檢測(cè)體系可以檢測(cè)拉米夫定治療的HBV患者微量的耐藥突變,對(duì)于乙肝病人臨床用藥指導(dǎo)及個(gè)體治療方案的調(diào)整有