弱精子癥患者精子中CRISP2基因及其蛋白產(chǎn)物的初步研究.pdf

1、不孕不育是全世界關(guān)注的研究課題。目前,不孕不育的發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。有統(tǒng)計(jì)研究表明在不孕不育中夫婦中由男方因素導(dǎo)致的已上升到了50％[1]。而近來(lái)有研究顯示,在因不孕不育而就診的夫婦中,由于男性因素所導(dǎo)致的不育提高到了2/3。
　　 對(duì)于由男性因素所導(dǎo)致的不育的臨床研究表明,男性精子活力低下是其主要的因素之一,臨床稱之為弱精子癥。臨床導(dǎo)致弱精子癥病因眾多,其中包括感染、精液液化異常、免疫因素、內(nèi)分泌因素、Kartagener

2、’s綜合征、染色體異常、精索靜脈曲張以及微量元素缺乏和不良生活習(xí)慣等因素。正是由于弱精癥病因眾多,發(fā)病機(jī)制尚不明確,所以臨床無(wú)法采取有效的、針對(duì)性的治療措施,其治療效果也不令人滿意,很多不孕不育夫婦最終只能選擇人工輔助生殖。有研究發(fā)現(xiàn),在一份正常的精液樣本中,在低活力精子中一些基因的表達(dá)明顯低于高活力精子。一些基因(如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11)[2]也已被證實(shí)與弱精子癥的發(fā)生有關(guān)。上述這些研究表明精子中某些

3、基因mRNA的表達(dá)水平的差異是與弱精子癥發(fā)生、發(fā)展是密切相關(guān)的。為了能更好的揭示這一現(xiàn)象,前期我們采用基因芯片技術(shù)對(duì)弱精子癥基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究,并從中篩選獲得部分弱精子癥差異表達(dá)基因。按照基因表達(dá)上調(diào)或下調(diào)2倍以上并且兩組樣本t檢驗(yàn)p<0.05的篩選標(biāo)準(zhǔn),在含有41000個(gè)基因的芯片中,芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)GeneSpring10.0表達(dá)譜分析軟件分析,共獲得1265個(gè)弱精子癥特異表達(dá)基因,其中307個(gè)基因在弱精子癥組中表達(dá)上調(diào),958個(gè)基

4、因在弱精子癥組中表達(dá)下調(diào)(Log2Ratio≤1或Log2Ratioi≥1 P<0.05)。但基因芯片作為一種高效、大規(guī)模地獲取生物信息的技術(shù),其所篩選所產(chǎn)生的海量數(shù)據(jù)中勢(shì)必存在部分假陽(yáng)性。而生物信息學(xué)作為近些年崛起的一門通過(guò)綜合利用生物學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)和信息技術(shù)的新興學(xué)科,它為從海量數(shù)據(jù)中去偽存真進(jìn)行挖掘數(shù)據(jù)提供了一種有效手段。本研究利用生物信息學(xué)工具對(duì)前期芯片篩查結(jié)果進(jìn)行深入挖掘,從中發(fā)掘出與弱精子癥相關(guān)基因,并對(duì)其進(jìn)行深入研究,闡述

5、其與成年男性弱精子癥發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系。本研究的主要研究方法、內(nèi)容和結(jié)論包括以下幾個(gè)方面:
　　 第1部分基于生物信息學(xué)弱精子癥相關(guān)基因挖掘
　　 目的:
　　 運(yùn)用多種生物信息學(xué)工具對(duì)前期基因芯片篩查所得弱精子癥差異表達(dá)基因(共獲得的1265個(gè)弱精子癥特異表達(dá)基因,其中307個(gè)基因在弱精子癥實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)上調(diào),958個(gè)基因在弱精子癥實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào))進(jìn)行深入發(fā)掘,從中篩選出與弱精子癥密切相關(guān)的弱精子癥特異表達(dá)基因,

6、并對(duì)其生物學(xué)功能以及與弱精子癥發(fā)生、發(fā)展關(guān)系進(jìn)行深入研究。
　　 方法:
　　 1.將前期基因芯片檢測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)GeneSpring10.0表達(dá)譜分析軟件分析所得的1265個(gè)弱精子癥特異表達(dá)基因,其中307個(gè)基因在弱精子癥實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)上調(diào),958個(gè)基因在弱精子癥實(shí)驗(yàn)組中表達(dá)下調(diào)(Log2Ratio≤1或Log2Ratio≥1 P<0.05)。分別導(dǎo)入在線分析軟件GATHER、PANTHER以及ToppGene。
　　

7、 2.運(yùn)用上述生物信息學(xué)軟件對(duì)上述差異基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析挖掘,對(duì)其功能進(jìn)行功能分析以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.差異基因GATHER分析將弱精子癥特異表達(dá)基因上傳導(dǎo)入GATHER在線軟件進(jìn)行分析,軟件共計(jì)可識(shí)別基因1205個(gè)。對(duì)差異基因進(jìn)行GO分類分析發(fā)現(xiàn),差異基因主要與細(xì)胞生理過(guò)程和物質(zhì)新陳代謝有關(guān),如G蛋白偶聯(lián)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細(xì)胞蛋白質(zhì)/大分子物質(zhì)新陳代謝有關(guān)；
　　 2.差異基因PAN

8、THER分析將弱精子癥特異表達(dá)基因?qū)隤ANTHER在線分析軟件,共計(jì)有932個(gè)基因可被識(shí)別,通過(guò)軟件分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),可被識(shí)別的差異基因pathway分析發(fā)現(xiàn)在整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、白介素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、過(guò)氧化應(yīng)激反應(yīng)、TGF—β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是上調(diào)的,而在腎上腺素/去甲腎上腺素合成、5-羥色胺合成、bZIP轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、組胺合成通路是下調(diào)的。
　　 3.ToppGene分析分別將在弱精子癥中上調(diào)表達(dá)差異基因30

9、7個(gè)、下調(diào)表達(dá)差異基因958個(gè)上傳導(dǎo)入ToppGene進(jìn)行在線功能分析。上調(diào)基因中共有234個(gè)可被識(shí)別,下調(diào)基因中共有663個(gè)可被識(shí)別。經(jīng)過(guò)軟件對(duì)差異基因參與生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在弱精子癥中上調(diào)表達(dá)的差異基因主要與細(xì)胞免疫應(yīng)答、抗原識(shí)別與呈遞、細(xì)胞死亡、凋亡以及介導(dǎo)細(xì)胞程序化死亡有關(guān)。而下調(diào)表達(dá)基因則主要與蛋白水解、細(xì)胞蛋白質(zhì)大分子物質(zhì)代謝、修飾相關(guān)的蛋白質(zhì)及大分子物質(zhì)代謝、蛋白K48泛素化過(guò)程以及微管細(xì)胞骨架構(gòu)成有關(guān)。
　　 結(jié)論

10、:
　　 1.通過(guò)生物信息學(xué)挖掘發(fā)現(xiàn)弱精子癥精子在活力下降的同時(shí),精子的基本生命活動(dòng)也下降,同時(shí)更易于發(fā)生凋亡、死亡。
　　 2.參與細(xì)胞骨架構(gòu)成、微管運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的一些差異表達(dá)基因,如KIF3B、MYO15A、KIF6、KIF26B、KIF3A、DNHD2、DMN、DYNC2H1、STARD9、MYOHD1、TPM1等,可能與弱精子癥相關(guān),值得進(jìn)一步深入研究。
　　 3.結(jié)合文獻(xiàn)挖掘發(fā)現(xiàn)CRISP2基因及其表

11、達(dá)產(chǎn)物與弱精子癥密切相關(guān),值得進(jìn)一步深入研究
　　 第2部分弱精子癥患者精子中CRISP2基因及蛋白初步研究
　　 目的:
　　 結(jié)合前期芯片篩查、生物信息學(xué)工具挖掘以及文獻(xiàn)挖掘,發(fā)現(xiàn)CRISP2基因及其蛋白質(zhì)表達(dá)產(chǎn)物與弱精子癥密切相關(guān)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討弱精子癥患者精子中CRISP2基因(富含半胱氨酸的分泌蛋白2)mRNA及蛋白的表達(dá)水平,探討其與精子活力的關(guān)系及相關(guān)的分子機(jī)制。
　　 方法:
　　

12、1.收集成年男性弱精子癥患者精液77例,活力正常精液67例作為對(duì)照組。采用50％Percoll離心分離純化后,-80℃保存；
　　 2.將收集的精子標(biāo)本從-80℃冰箱中取出,37℃水浴箱解凍,每四份合為一份,采用RNeasy mini kit提取精子RNA。采用轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealTime-PCR),SYBR Green熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)CRISP2 mRNA表達(dá)量；
　　 3.凍存標(biāo)本解凍后,采用總

13、蛋白提取試劑盒提取總蛋白,免疫印跡(WesternBlot)檢測(cè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。
　　 4.CRISP2蛋白STRING分析,將CRISP2蛋白名上傳至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(網(wǎng)址http://string-db.org/),對(duì)與CRISP2蛋白相關(guān)蛋白及其之間相互作用進(jìn)行分析。
　　 5.進(jìn)一步結(jié)合文獻(xiàn)挖掘?qū)RISP2基因及其蛋白表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行深入研究。
　　 結(jié)果:
　　 1.CRISP2基因在弱精子癥患

14、者精子中的表達(dá)量明顯低于其在正常對(duì)照組精子中的表達(dá)量,下調(diào)達(dá)4.3倍；
　　 2.Western Bbt發(fā)現(xiàn)CRISP2蛋白在弱精子癥組較正常對(duì)照組下調(diào)約1.71倍,兩組之間的表達(dá)量有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　 3.STRING分析提示CRISP2蛋白與GRSF1、GGN、TPX2、SPATA22、MAP3K11、NSUN4、PGK2、SPZ1、LDHC、LUZP4等蛋白存在相互作用。
　　 結(jié)論:

15、
　　 1.CRISP2基因除通過(guò)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與精子發(fā)育調(diào)節(jié),還通過(guò)RyR受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,影響精子Ca2+通道的活性,其蛋白類表達(dá)產(chǎn)物直接參與精子尾部重要細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)構(gòu)。
　　 2.CRISP2基因以及蛋白的表達(dá)水平與精子活力密切關(guān)系。弱精子癥患者精子中CRISP2基因mRNAs及蛋白表達(dá)下調(diào)可能與精子活力下降有密切的聯(lián)系。
　　 3.提示CRISP2基因及蛋白可能會(huì)成為潛在的診斷標(biāo)記物,這一基因的進(jìn)一