正常男性和白細(xì)胞精子癥患者精子線粒體基因缺失和含量的研究.pdf

1、本研究的目的是測(cè)定正常人與白細(xì)胞精子癥患者精子線粒體DNA(MtDNA)含量、MtDNA<'4977bp>缺失及體內(nèi)活性氧(ROS)水平，探討精液中白細(xì)胞增加、活性氧水平升高與精子MtDNA變化的關(guān)聯(lián)。 經(jīng)典理論認(rèn)為：精子在體外運(yùn)動(dòng)唯一能量來(lái)源是位于其中部線粒體構(gòu)成的線粒體鞘。線粒體結(jié)構(gòu)、功能的完整性直接影響精子的活力。而精子活力是衡量男性生育能力的重要指標(biāo)之一。精子線粒體結(jié)構(gòu)、功能很大程度上影響男性的生育力。線粒體的呼吸鏈?zhǔn)腔?/p>

2、性氧(Reactive oxygen specias，ROS)的主要來(lái)源，正常生理?xiàng)l件下，存在于體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)可清除過(guò)多的ROS；但在某些病理?xiàng)l件下(如：白細(xì)胞精子癥)可以產(chǎn)生遠(yuǎn)多于正常情況下的ROS。由于精子線粒體DNA(MtDNA)是無(wú)組蛋白包裹裸露的DNA分子、且線粒體內(nèi)缺乏有效的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，故易造成MtDNA損傷。從而對(duì)男性生育能力產(chǎn)生影響。 流式細(xì)胞儀檢測(cè)熒光值的方法是利用流式細(xì)胞儀對(duì)處于快速流動(dòng)的細(xì)胞進(jìn)行多

3、參數(shù)、快速的定量分析。具有快速、高通量、精確定量的優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)不發(fā)光的1mmol/L 2.7-二氯氫化熒光素二酯(DCFH-DA)進(jìn)入細(xì)胞后，經(jīng)過(guò)酯酶作用脫去二酯(DA)，生成不發(fā)熒光的2.7-二氯氫化熒光素(DCFH)，DCFH被活性氧氧化生成發(fā)熒光的2.7-二氯氫化熒光黃(DCF)，由于活性氧自由基的含量與熒光探針的熒光強(qiáng)度成正比，因此可以定性定量的檢測(cè)活性氧自由基的動(dòng)態(tài)變化。 通過(guò)此種原理我們對(duì)對(duì)照組與病例組男性精漿中活性氧的

4、含量進(jìn)行了檢測(cè)。我們發(fā)現(xiàn)對(duì)照組與病例組男性精漿活性氧含量存在顯著的差異(p值<0.0001)。這與Saleh等學(xué)者發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞精子癥患者ROS含量顯著增高的結(jié)果完全一致。 熒光實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)是一項(xiàng)發(fā)展的比較成熟的研究手段，目前廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域的研究。此種技術(shù)具有快速、精確、靈敏的特點(diǎn)，能定量的檢測(cè)目的基因拷貝數(shù)目、表達(dá)量的變化，可以對(duì)精子線粒體DNA的含量及大片段的缺失情況作出

5、定量檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)采用Percoll梯度離心法將精液樣本中的精子分為上清層、30％和80％精子層，分別應(yīng)用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)精子MtDNA含量及MtDNA<'4977bp>缺失進(jìn)行定量分析。結(jié)果表明：上清層、30％層與80％層中，正常組與病例組精子MtDNA平均含量為1.05-9.78個(gè)拷貝。與對(duì)照組比較，病例組各層精子MtDNA含量均顯著升高，其p值均<0.001。在上清層和80％層，病例組MtDNA<'4977bp>缺失與對(duì)照組

6、差異不顯著；而在30％層，病例組MtDNA<'4977bp>缺失明顯高于對(duì)照組(p<0.0001)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照組與病例組各樣本中ROS含量分別與30％層精子和80％層精子的MtDNA含量間呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.347，p<0.0001；r=0.456，p<0.0001)，與上清層精子MtDNA含量無(wú)相關(guān)性。結(jié)論：白細(xì)胞增多和活性氧升高可能是導(dǎo)致精子MtDNA含量顯著增高的原因之一，但是對(duì)于MtDNA<'4977bp>缺失的