固有免疫信號因子MyD88和TRIF在CC14致大鼠肝纖維化模型中的表達.pdf

1、越來越多的研究顯示，肝臟在慢性炎癥性損傷之后繼發(fā)肝纖維化，而炎癥反應在肝纖維化形成與發(fā)展過程中起著非常重要的作用。酒精、病原微生物以及其它相關炎性反應物也能激活機體免疫系統(tǒng)誘發(fā)炎癥反應進而導致肝纖維化的形成。在肝臟炎癥反應急性期與慢性期，肝細胞、內(nèi)皮細胞、肝星狀細胞等分泌多種細胞因子和趨化因子，誘導炎性細胞浸潤于損傷部位，參與介導急性期的免疫性炎癥反應和損傷組織的修復反應。
　　Toll受體是一個能感知病原體并直接作出防御性反應的

2、天然免疫受體。主要包括MyD88和TRIF兩種主要的信號因子通路。所有的TLR適配器在介導細胞內(nèi)信號轉導上都具有重要的積極作用。有研究顯示，肝細胞上表達一些可以被炎癥或前炎性因子調節(jié)的TLRs。肝細胞表面TLR的表達在肝臟疾病的發(fā)生及其所致的肝細胞損傷中亦起著重要的作用。包括LPS與其受體TLR4結合，激活下游信號轉導途徑，在機體內(nèi)產(chǎn)生一系列的免疫應答，從而促成了纖維化的發(fā)生。因此，TLRs在肝纖維化的形成過程中發(fā)揮重要的作用。但是目前

3、的研究主要集中于上游信號，而對固有免疫下游信號因子在肝纖維化中表達的特點和規(guī)律報道很少。
　　MyD88和TRIF作為重要信號通路，但對其表達變化的特點目前仍然不太清楚。因此，針對Toll下游重要信號因子MyD88和TRIF表達與作用特點的研究，對探討肝纖維化的發(fā)病機制及治療中具有重要意義。
　　研究目的
　　觀察固有免疫信號因子MyD88在肝纖維化大鼠肝臟中的表達特點，探討MyD88與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關系。研究固有

4、免疫信號因子TRIF在肝纖維化大鼠肝臟中細胞形態(tài)學表達特點、基因和蛋白表達規(guī)律，探討TOLL樣受體下游重要的信號因子TRIF與肝纖維化發(fā)生發(fā)展的病理機制關系。
　　方法
　　1.造模與取材：將40只SD大鼠隨機分成正常對照組(10只)和實驗組(30只)。實驗組大鼠給予自行配制的高脂低蛋白飼料(包含39.5％玉米面+40％面粉+20％豬油+0.5％膽固醇)，同時給予實驗組大鼠背部皮下注射CC14油劑，每周2次，共計12周。第一

5、周的2次皮下注射劑量皆為0.5ml/100g體重，以后每次注射劑量為0.3ml/100g體重，安排每周星期2和星期5進行。每天10％酒精作為唯一飲料。正常對照組大鼠正常普通飼料喂養(yǎng)。取材：在無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動脈采血，注入加有肝素的無熱源玻璃試管中，離心取血漿置于玻璃試管中封口，低溫保存。取新鮮肝左葉一部分立即固定于4％多聚甲醛，24 h內(nèi)進行脫水、透明、石蠟包埋；一部分置于-80℃保存。
　　2.HE染色：肝組織石蠟切

6、片進行常規(guī)HE染色，觀察肝臟病變。
　　3.免疫組化檢測：標本常規(guī)脫蠟、梯度脫水、過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶，檸檬酸熱修復。山羊血清封閉(1％TritonX-100)15分鐘。兔抗MyD88，按1:50稀釋作為一抗，4℃過夜，HRP標記的二抗37℃孵育60分鐘，PBS沖洗，DAB顯色、脫水、透明、封片后鏡檢。
　　4.RT-PCR法檢測黑質MyD88的表達：提取大鼠肝臟總RNA，然后在42℃條件下逆轉錄20分鐘，產(chǎn)物為cD

7、NA。擴增反應，PCR產(chǎn)物電泳。凝膠成像儀采圖，Quantityone one圖像分析軟件分析。
　　5電鏡標本制作與檢測
　　用10 g/L戊巴比妥鈉按50 mg/kg腹腔注入麻醉大鼠，取出肝臟用0.1 mol/L的PBS溶液沖洗，切成小的組織片，放入2％多聚甲醛.2.5％戊二醛預固定。冷緩沖液漂洗15 min×3次，1％餓酸常溫固定2 h按照電鏡常規(guī)包埋、切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重電子染色，HitachiS-7500

8、透射電鏡觀察。
　　6.Western blot檢測：裂解肝組織，BCA法蛋白定量，積層膠和分離膠電泳，轉到硝酸纖維素膜，脫脂奶粉室溫封閉，兔抗MyD88多克隆抗體4℃過夜，PBST洗后，加入辣根酶標記的山羊抗兔IgG，室溫2h，化學發(fā)光檢測與軟件分析。
　　7.大鼠行為學觀察：在實驗過程中，密切觀察各組大鼠行為學的變化，判斷是否有異常表現(xiàn)。
　　8、統(tǒng)計學處理：使用SPSS17.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)用()±s表

9、示，多組間比較先進行單因素方差齊性檢驗，方差齊者進行方差分析，方差不齊者進行秩和檢驗，P<0.05表明具有統(tǒng)計學意義。
　　結果
　　1.行為學評價：正常對照組大鼠健康狀況良好，精神狀態(tài)佳，體重正常，飲食正常，毛質光亮。取出肝的標本可見肝面潤滑紅潤，質地柔軟；而模型組大鼠的活動量下降，飲食減少，毛質無光澤晦暗，精神不佳，體重明顯F降。取出肝臟灰暗有積結，重量增加。
　　2.免疫組化檢測結果：正常組大鼠肝小葉結構排列規(guī)則

10、有序，未見異常細胞等結構出現(xiàn)。在正常肝臟細胞中，肝臟實質細胞微弱表達，MyD88和TRIF的表達主要集中于一些枯否細胞、血管內(nèi)皮細胞、膽管上皮細胞等非實質性肝細胞。模型組肝小葉結構明顯破壞，數(shù)量明顯減少，結構紊亂無序，代之以大量異常細胞浸潤，纖維增生等特點。MyD88和TRIF表達明顯增加，內(nèi)皮細胞、星形細胞等都有強烈表達，并且以胞核表達為主，而陽性與陰性對照沒有陽性表達產(chǎn)物出現(xiàn)。
　　3.RT-PCR檢測MyD88 mRNA的表

11、達：與正常對照組相比，肝纖維化組MyD88 mRNA表達明顯升高，差異有顯著性意義(*p<0.01)。
　　4.Western blot檢測MyD88和TRIF蛋白的表達：與正常對照組相比，肝纖維化組MyD88和TRIF蛋白表達明顯升高，差異有顯著性意義(*p<0:01)。
　　5.透射電鏡結果檢測
　　正常對照組大鼠肝細胞胞膜完整，胞質均勻，細胞核圓且居中，核仁明顯。肝竇周間隙未見纖維沉積，脂滴少見；與正常對照組相比

12、，肝纖維化組可見高密度物質，肝細胞周圍有大量膠原纖維沉積現(xiàn)象。竇周纖維化以及狄氏間隙擴張明顯，并且可見成脂細胞；胞質可見明顯的溶解現(xiàn)象，在狄氏腔內(nèi)，肝星狀細胞的細胞核溶解，血竇內(nèi)皮細胞胞質、胞核皆溶解。
　　結論
　　1.MyD88基因和蛋白表達在肝纖維化中顯著增強，在肝臟實質細胞和非實質細胞都有明顯表達分布，說明MyD88可能在纖維化形成中起重要作用。
　　2.TRIF蛋白表達在肝纖維化中顯著增強，在肝臟實質細胞和非