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文檔簡介
1、背景:膿毒癥是指宿主對感染的反應(yīng)失調(diào),產(chǎn)生危及生命的器官功能障礙,是嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、休克后常見的并發(fā)癥。近年來,盡管在嚴(yán)重膿毒癥及膿毒性休克的抗感染、液體復(fù)蘇、創(chuàng)面處理、器官支持治療等方面已取得進(jìn)展,但其病死率仍居高不下,是重癥監(jiān)護(hù)室(intensive care unit,ICU)病人的首要死亡原因。膿毒癥患者免疫功能受到抑制,自身清除感染的能力降低,是患者感染難以控制的重要原因??股氐氖褂锰岣吡四摱景Y患者的救治成功率,但隨著抗生素
2、的長期應(yīng)用,不敏感菌株大量繁殖,抗生素不能完全解決膿毒癥時的感染問題。因此,如何改善膿毒癥時患者自身的免疫功能從而有效地控制感染,是膿毒癥防治的重要課題。膿毒癥時,在多種細(xì)菌毒素及細(xì)胞因子的刺激下,中性粒細(xì)胞功能失調(diào),趨化方向性受損,到達(dá)病原感染部位的中性粒細(xì)胞數(shù)量減少,不能有效抑制病原增殖,導(dǎo)致機體抵御感染的能力降低,影響重要臟器的功能,是膿毒癥患者死亡的重要原因之一。進(jìn)一步闡明膿毒癥時中性粒細(xì)胞方向性受損的機制,尋找針對性的干預(yù)措施
3、,使中性粒細(xì)胞向感染部位的趨化增強,可為膿毒癥的抗感染治療提供理論基礎(chǔ)。
內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁表面的主要組成成分,過量的LPS可導(dǎo)致天然免疫細(xì)胞的過度活化,釋放過多的炎癥介質(zhì),通過自分泌、旁分泌和體循環(huán)作用于全身組織器官,是引起膿毒癥時全身炎癥反應(yīng)綜合征的重要原因。ATP是細(xì)胞內(nèi)重要的能量分子,近年來,Junger等人發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞也可通過自分泌ATP途徑對自身的趨
4、化產(chǎn)生影響。中性粒細(xì)胞趨化時前端片足分泌的ATP通過自分泌途徑激活自身局部的P2Y2受體,增強了細(xì)胞的運動功能,但當(dāng)細(xì)胞整體都接受ATP的刺激時,中性粒細(xì)胞的趨化功能反而受到抑制,這提示胞外ATP亦可能是中性粒細(xì)胞趨化的抑制分子,但其具體分子機制目前并不明確。P2X1受體是ATP門控陽離子通道受體,與ATP結(jié)合后能迅速誘導(dǎo)細(xì)胞的Ca+內(nèi)流,是細(xì)胞重要的Ca2+內(nèi)流通道。近年來的研究證實P2X1受體也表達(dá)于外周血中性粒細(xì)胞中,ATP可通過
5、活化P2X1受體增強中性粒細(xì)胞的隨機運動,但隨機運動的中性粒細(xì)胞不具有方向性,損傷了其向趨化物的定向運動能力,減弱了中性粒細(xì)胞向感染部位的特異性趨化能力。Ca+是細(xì)胞內(nèi)重要的信號分子,參與調(diào)控了中性粒細(xì)胞的多種生物學(xué)功能,但過度的Ca2+內(nèi)流對中性粒細(xì)胞的趨化則具有抑制作用,但其是否與P2X1受體的活化有關(guān)目前尚不明確。
方法:體內(nèi)實驗采用致死劑量和非致死劑量的大腸埃希菌腹腔注射,制作膿毒癥感染小鼠模型和輕度局部感染小鼠模型,
6、觀察小鼠生存率,血細(xì)胞自動分析儀檢測腹腔灌洗液、血液中性粒細(xì)胞數(shù)量,平板菌落計數(shù)法檢測腹腔灌洗液、血液細(xì)菌含量。病理切片HE染色觀察小鼠膿毒癥后肝、肺損傷,ELISA試劑盒檢測肝、肺IL-1β、IL-6細(xì)胞因子水平,MDA試劑盒檢測肝、肺MDA含量,轉(zhuǎn)錄譜基因芯片檢測中性粒細(xì)胞基因表達(dá)的差異。
體外實驗采用LPS刺激原代中性粒細(xì)胞模型,瓊脂糖趨化實驗檢測中性粒細(xì)胞趨化距離,流式細(xì)胞儀檢測中性粒細(xì)胞趨化分子受體表達(dá)及凋亡,高效液
7、相色譜儀檢測ATP釋放,Western Blot檢測Cx43蛋白磷酸化,激光共聚焦顯微鏡檢測P2X1受體分布、Ca2+內(nèi)流,原子力顯微鏡、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細(xì)胞極性化,激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白肌球蛋白輕鏈(myosin lightchain,MLC)磷酸化、極性化。
采用CRISPR/Cas9慢病毒敲除HL-60早幼粒細(xì)胞株P(guān)2X1受體,1.3%二甲基亞砜處理HL-60細(xì)胞6d后分化成類中性粒細(xì)胞,原子力顯微鏡
8、、場發(fā)射掃描電子顯微鏡檢測中性粒細(xì)胞極性化,激光共聚焦顯微鏡檢測骨架蛋白MLC磷酸化、極性化。
結(jié)果:體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥時中性粒細(xì)胞趨化功能受到抑制、清除感染能力受損,肝、肺組織病理損傷明顯、炎癥反應(yīng)增強,進(jìn)一步的基因芯片檢測發(fā)現(xiàn)膿毒癥時中性粒細(xì)胞TLR信號通路活化,LPS通過TLR4對中性粒細(xì)胞多種的趨化分子受體的表達(dá)產(chǎn)生調(diào)控作用。
體外研究發(fā)現(xiàn)在膿毒癥時重要的炎癥刺激分子中LPS對中性粒細(xì)胞趨化的抑制作用最為明顯
9、,LPS通過促進(jìn)Cx43通道開放分泌ATP,ATP作用于自身P2X1受體后引起過量的Ca2+內(nèi)流,使中性粒細(xì)胞鈣調(diào)蛋白MLCK活化,導(dǎo)致MLC異常磷酸化及極性化,抑制了中性粒細(xì)胞的趨化。P2X1受體敲除后,LPS對中性粒細(xì)胞的抑制作用被削弱,MLC磷酸化、極性化恢復(fù)正常。
結(jié)論:本研究通過體內(nèi)、體外研究發(fā)現(xiàn)了LPS刺激后自分泌ATP/P2X1/Ca2+信號通路對中性粒細(xì)胞趨化的抑制作用,并揭示其對中性粒細(xì)胞骨架蛋白MLC異常極
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