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文檔簡介
1、第一部分馬齒莧總黃酮的提取和其含量及相關(guān)成分染料木苷含量的測定
【目的】:
在前期研究的基礎(chǔ)上,本實驗主要提取和制備馬齒莧黃酮有效部位,同時利用高效液相鑒定馬齒莧黃酮的相關(guān)成分,用RP-HPLC對相關(guān)成分的含量進行測定。
【方法】:
每公斤馬齒莧全草用含3%(g/ml)氫氧化鈉和60%(ml/ml)乙醇堿性醇液煎煮三次,時間分別為2 h、1h、0.5h,收集三次提取液,蒸發(fā)其中的乙
2、醇至無醇味。
將濃縮提取液上1m×10cm的聚酰胺柱,柱高40cm,吸咐2h, 倒掉濾液,再用雙蒸水反復(fù)洗脫至洗脫液無色為止,棄此洗脫液;最后用95%(ml/ml)乙醇洗脫,至洗脫液為淡黃色時停止,收集此洗脫液,進一步用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)得含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液。
利用黃酮與亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉形成絡(luò)合物,用分光光度計在510nm可見光處測定其吸收度,進行總黃酮含量的測定。用RP-HPLC
3、鑒定馬齒莧黃酮的相關(guān)成分并進行含量測定。
【結(jié)果】:
馬齒莧總黃酮的含量占其全草總重量的7.67%,該產(chǎn)品可用于制備胰島素增敏劑。馬齒莧黃酮部位中染料木苷與標準品中染料木苷保留時間一致,染料木苷在6.25 μg.L-1~200.00μg.L-1線性關(guān)系良好,r=0.9999。含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液中染料木苷含量為1.68mg.L-1。
【結(jié)論】:
馬齒莧全草中含7
4、.67%黃酮,染料木苷為本總黃酮的相關(guān)成分,含生藥6 kg.L-1的馬齒莧黃酮提取液中染料木苷含量為1.68mg.L-1。
第二部分染料木苷改善HepG2細胞中FFAs誘導(dǎo)的胰島素抵抗
【目的】:
在前期實驗的基礎(chǔ)上,本實驗采用軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細胞產(chǎn)生胰島素抵抗,同時觀察染料木苷對HepG2胰島素抵抗細胞培養(yǎng)基中葡萄糖消耗的影響以及染料木苷影響葡萄糖消耗的初步機理。
【方法】:
5、
體外培養(yǎng)HepG2細胞,用0.5mmol/L軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細胞造胰島素抵抗模型,同時使用不同濃度的染料木苷(1、2、4μmol/L)以及作為陽性對照的羅格列酮(1μmol/L)干預(yù)24 h,用MTT法檢測藥物對細胞增殖能力的影響,用葡萄糖氧化酶法測定培養(yǎng)基中葡萄糖的含量,用免疫印跡的方法測定葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(GLUT1)的表達水平。
【結(jié)果】:
與正常對照組比較,1-4μmol/L的染料
6、木苷對HepG2細胞增殖的影響無明顯差異(P>0.05),葡萄糖消耗量隨著染料木苷的濃度增加而明顯提高,各組與模型組比較差異明顯(P<0.05 or P<0.01),葡萄糖消耗量最大增多0.35mM;治療各組中HepG2細胞GLUT1蛋白表達水平與模型組比較明顯增強。
【結(jié)論】:
染料木苷能改善軟脂酸誘導(dǎo)HepG2細胞的胰島素抵抗,作用隨劑量增加而增強。
第三部分
染料木素通過抑制
7、JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路改善HepG2細胞中胰島素抵抗的實驗研究【目的】:
本實驗重點研究染料木素對HepG2細胞胰島素抵抗的改善作用。通過觀察各組HepG2細胞培養(yǎng)基中葡萄糖含量在用藥前后的變化,測定J NK信號通路各級信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達情況,對染料木素逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗的作用和分子機理做進一步的研究。
【方法】:
模型組用含0.5 mmol/L PA/0.2% BSA無血清的高糖(22.2mmol/L
8、)DMEM培養(yǎng)HepG2細胞,建立HepG2細胞胰島素抵抗模型;正常組用含或不含1nmol/L胰島素、0.2% BSA無血清的高糖(22.2mmol/L)DMEM培養(yǎng)HepG2細胞;模型組用含或不含1nmol/L胰島素造模液造模;陽性對照組用含或不含1nmol/L胰島素造模液培養(yǎng),同時加入1μmol/L羅格列酮干預(yù);不同劑量染料木素組用含或不含1nmol/L胰島素造模液培養(yǎng),分別同時加入1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L染料
9、木素。干預(yù)24小時后,取出各組培養(yǎng)液用葡萄糖氧化酶法檢測葡萄糖含量。用MTT法檢測藥物對細胞增殖能力的影響,用免疫印跡的方法測定JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中T-JNK、P-JNK、IRS-1、IRS-1Ser307、PI-3K p85、GLUT1的蛋白的表達。
【結(jié)果】:
與正常組比較,含胰島素的模型組葡萄糖消耗明顯降低(P<0.01);與模型組比較,含胰島素的羅格列酮組和不同劑量染料木素組葡萄糖消耗明顯增加(P<0
10、.05 or 0.01),無胰島素各組葡萄糖消耗無明顯區(qū)別。免疫印跡結(jié)果表明,與正常組比較,模型組中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表達顯著增加,IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表達明顯減少;與模型組比較羅格列酮組和不同劑量染料木素組中T-JNK、P-JNK、IRS-1Ser307蛋白表達顯著減少,IRS-1、PI-3K p85、GLUT1表達明顯增加。
【結(jié)論】:
染料木素與羅格
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