重組人促血小板生成素通過(guò)降低炎性反應(yīng)抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生.pdf

1、目的:
　　 瘧疾是由瘧原蟲引起的嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染性疾病之一。而作為瘧疾的重要并發(fā)癥，腦型瘧疾（腦瘧）是引起瘧疾感染患者死亡的主要原因。目前仍然沒(méi)有有效的措施可以控制腦型瘧疾的發(fā)生與進(jìn)展。當(dāng)前學(xué)者們普遍認(rèn)為機(jī)體過(guò)度的炎性反應(yīng)與腦瘧的發(fā)生密切相關(guān)。因此通過(guò)調(diào)控瘧疾患者機(jī)體的炎性應(yīng)答來(lái)防控腦瘧一直是重要的研究方向。近年來(lái)眾多的研究發(fā)現(xiàn)一些造血細(xì)胞生成因子除了具有促進(jìn)血細(xì)胞生成的作用之外，還具有其他的非造血功能。如促紅細(xì)胞生

2、成素(EPO)可促進(jìn)紅細(xì)胞生成，還具有抗炎性反應(yīng)等多種功能，并被證實(shí)能夠抑制實(shí)驗(yàn)性腦型瘧疾的發(fā)生。而作為最主要的促血小板生成因子，促血小板生成素(TPO)在分子結(jié)構(gòu)上與EPO具有一定的同源性(23％)，且其受體c-Mpl也表達(dá)于某些免疫細(xì)胞，并可在一定程度上影響免疫細(xì)胞的功能。腦瘧的發(fā)病機(jī)制及臨床表現(xiàn)與腦栓塞具有一定共性，而近期有研究證實(shí)在大鼠的實(shí)驗(yàn)性缺血性腦栓塞模型中，重組人促血小板生成素(rhTPO)能通過(guò)降低MMP-9水平阻斷抑制

3、血腦屏障的破壞。由于炎性反應(yīng)能夠誘導(dǎo)MMP-9的產(chǎn)生，有理由推測(cè)TPO可能是通過(guò)降低炎性反應(yīng)抑制血腦屏障的破壞。而rhTPO可能因此能夠在腦瘧中的發(fā)揮保護(hù)性作用。為此，本研究擬利用rhTPO處理感染后的小鼠腦瘧模型，探討rhTPO對(duì)小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧發(fā)生的影響及其免疫相關(guān)機(jī)制。
　　 材料與方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型構(gòu)建與分組
　　 6-8周齡，雌性C57BL/6小鼠（購(gòu)買于北京動(dòng)物研究所）隨機(jī)分為3組，正常對(duì)照

4、組（不予任何處理與干預(yù)），感染對(duì)照組，rhTPO處理感染組。感染對(duì)照組與rhTPO處理感染組小鼠經(jīng)腹腔感染1×106 P.bANKA(PbA)寄生的紅細(xì)胞(pRBC)，構(gòu)建腦瘧模型。rhTPO處理感染組于感染后第一天經(jīng)尾靜脈注射一次rhTPO(4μg/kg)。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)態(tài)觀察生存率，制備薄血涂片，Giemsa染色，鏡檢計(jì)數(shù)紅細(xì)胞感染率。
　　 2.血腦屏障(BBB)通透性檢測(cè)
　　 感染后第5-12天，小鼠出現(xiàn)腦瘧癥狀，

5、通過(guò)尾靜脈注射伊文思藍(lán)(Evans blue)檢測(cè)血腦屏障通透性變化。
　　 3.腦組織病理及免疫組化
　　 感染后第5天，獲取各組小鼠全腦，制備石蠟切片，HE染色觀察腦組織病理變化，免疫組化染色觀察統(tǒng)計(jì)表達(dá)VCAM-1與ICAM-1的大腦皮質(zhì)微血管數(shù)量。
　　 4.腦組織mRNA檢測(cè)樣本的留存
　　 感染后第5天，獲取小鼠全腦，置于RNAlater中，-20℃保存，待實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-

6、Time PCR)檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA水平。
　　 5.腦組織單個(gè)核細(xì)胞分離
　　 感染后第5天，用Percoll分離全腦單個(gè)核細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T與CD8+T細(xì)胞水平。
　　 6.血液學(xué)分析
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5、8天，經(jīng)眼球取血，獲得EDTA抗凝血，自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測(cè)紅細(xì)胞與血小板數(shù)量。
　　 7.獲取血清
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5天，經(jīng)眼

7、球取血，分離血清，-20℃凍存，待細(xì)胞因子檢測(cè)。
　　 8.制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液
　　 感染前（第0天）及感染后第3、5天，無(wú)菌制備脾臟單個(gè)核細(xì)胞懸液，其中部分細(xì)胞經(jīng)48小時(shí)培養(yǎng)后，收集上清，-20℃凍存，待細(xì)胞因子檢測(cè);部分細(xì)胞溶解于Trizol中，-70℃凍存，待Real-Time PCR檢測(cè)細(xì)胞因子的mRNA水平;部分細(xì)胞用于流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同免疫細(xì)胞亞群的水平。
　　 9.流式細(xì)胞術(shù)
　　 流式

8、細(xì)胞術(shù)檢測(cè)感染后第5天腦組織單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T與CD8+T細(xì)胞的水平，感染前（第0天）及感染后第3、5天脾臟中Th1細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）水平、不同樹突狀細(xì)胞(DCs)亞群及其功能相關(guān)分子的水平，外周血活化血小板的水平。
　　 10.Real-Time PCR
　　 Real-Time PCR檢測(cè)感染后第5天腦組織及第3、5天脾細(xì)胞腦瘧相關(guān)細(xì)胞因子的mRNA水平。
　　 11.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(EL

9、ISA)
　　 ELISA檢測(cè)感染前（第0天）及感染后第3、5天脾細(xì)胞培養(yǎng)上清與血清中細(xì)胞因子水平。
　　 12.Griess法
　　 Griess法檢測(cè)感染前（第0天）及感染后第3、5天脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO2-濃度。
　　 13.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 使用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，標(biāo)本采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較分析組內(nèi)和組間均值差異，采用Kaplan-Meyer方法進(jìn)行生存期分析。P＜0.

10、05為顯著差異。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 rhTPO可以顯著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠的實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生，但不改變?cè)x血癥。rhTPO明顯抑制感染小鼠血腦屏障對(duì)伊文思藍(lán)的通透性。rhTPO抑制感染小鼠腦部炎性反應(yīng)的升高。腦組織切片的HE染色結(jié)果顯示，rhTPO處理感染組的腦皮質(zhì)血管炎性細(xì)胞聚集與粘附現(xiàn)象明顯少于感染對(duì)照組。腦部單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T與CD8+T細(xì)胞水平，在rhTPO處理組明顯低于感染對(duì)照組。與感染

11、對(duì)照組相比，在rhTPO處理組，腦部與腦瘧發(fā)生密切相關(guān)的炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α)和趨化因子(CXCL9與CXCL10)的mRNA水平明顯下調(diào)，MMP-9的mRNA水平降低，而TGF-β1的mRNA水平顯著升高。腦組織免疫組化結(jié)果顯示，在rhTPO處理組，表達(dá)粘附分子VCAM-1與ICAM-1的大腦皮質(zhì)微血管數(shù)量顯著低于感染對(duì)照組，與此相一致的是，腦部VCAM-1與ICAM-1的mRNA水平，在rhTPO處理組明顯低于感染對(duì)

12、照組。血清細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示感染后第5天，rhTPO處理組的IFN-γ、TNF-α水平顯著低于感染對(duì)照組。脾臟的相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)表明rhTPO能夠顯著影響機(jī)體的免疫應(yīng)答。與感染對(duì)照組相比，rhTPO處理感染組的Th1免疫應(yīng)答顯著降低，表現(xiàn)為感染后第3、5天Th1細(xì)胞水平下降，脾細(xì)胞產(chǎn)生的NO減少，感染后第5天的IFN-γ與TNF-α蛋白及mRNA水平明顯下調(diào)，而Tregs水平顯著升高。感染后第3天，rhTPO處理感染組的髓樣樹

13、突狀細(xì)胞(mDCs)及DCs功能相關(guān)分子(MHCII、CD86、TLR4、TLR9)水平明顯低于感染對(duì)照組。rhTPO介導(dǎo)保護(hù)作用的同時(shí)，不影響外周血紅細(xì)胞與血小板數(shù)量，但降低感染后第3天的活化血小板水平。
　　 結(jié)論:
　　 1.rhTPO能夠顯著抑制感染PbA的C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性腦瘧的發(fā)生;
　　 2.rhTPO可明顯抑制實(shí)驗(yàn)性腦瘧模型小鼠血腦屏障通透性的增加;
　　 3.rhTPO能夠明顯降低