造血干細胞移植后CMV感染的基因和免疫因素研究.pdf

1、目的:
　　 巨細胞病毒(CMV)是造血干細胞移植后最常見機會性感染源之一，在造血干細胞移植早期CMV疾病的死亡率達80％以上，早期預防和診斷是減少CMV疾病發(fā)生的關鍵。CMV感染和致病受到病毒本身基因、宿主基因和機體免疫因素的影響，本研究目的是探索CMVgB基因分型和造血干細胞移植前供受體HLA和非HLA基因，KIR基因，以及移植后受體免疫狀態(tài)等因素對CMV感染致病的影響，為合理選擇供體，制定合適的病毒預防方案提供參考價值。<

2、br>　　 方法:
　　 第一部分選擇2004年7月至2010年5月接受造血干細胞移植并且CMV-DNA陽性的115例CMV感染者，采用熒光定量PCR檢測病毒載量，聚合酶鏈式反應一限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法和克隆測序?qū)λ蠧MV感染者的CMV-DNA進行CMVgB基因分型鑒定，分析不同CMVgB基因型患者病毒載量，抗病毒治療時間以及CMV疾病發(fā)生的差異。
　　 第二部分選擇2004年10月-2010年

3、10月行造血干細胞移植供受體433對，移植前采用序列特異性寡核苷酸探針雜交(PCR/SSO)低分辨分型方法對供受體HLA-Ⅰ抗原以及HLA-Ⅱ類抗原進行檢測，移植后2周起，每周采用熒光免疫組化法檢測移植后患者外周血CMVpp65抗原結合臨床資料，分析在CMV陽性組與CMV陰性組，CMV抗原血癥組與CMV疾病組供受體HLA-A，B，C，DRB1，DQB1，E位點頻率的差異。
　　 第三部分選擇2005年10月-2010年10月行造

4、血干細胞移植供受體138對，移植前采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(PCR-SSP)方法對供受體KIR基因分型，移植后2周起，每周采用熒光免疫組化法檢測移植后受體外周血CMVpp65抗原，分析在CMV陽性組與CMV陰性組，供受體KIR抑制性受體基因與激活性受體基因以及供受體KIR單體型頻率的差異。
　　 第四部分選擇2007年7月至2010年12月行造血干細胞移植供受體64對，采用聚合酶鏈反應-序列特異性引物(PCR-SSP)和基

5、因測序方法(SBT)對非HLA基因(ACE、CD14、MPO、MBL)檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，結合CMVpp65檢測結果，比較CMV陽性組與CMV陰性組ACE、CD14、MPO、MBL基因SNPs的差異。
　　 第五部分選擇2008年1月-2010年12月行造血干細胞移植患者92例，移植后2周起，每周采用熒光免疫組化法檢測移植后患者外周血CMVpp65抗原；采用

6、流式技術和定量PCR方法連續(xù)檢測移植后30天，60天，90天T細胞亞群重建，NK細胞受體和負調(diào)控基因SOCS1，SOCS3的表達，比較CMV陽性組與陰性組免疫狀態(tài)的差異。
　　 結果:
　　 第一部分①115例CMVgB基因型分布為：gB1，42/115(36.52％)：gB2，3/115(2.61％)；gB3，43/115(37.39％)；gB4，2/115(1.74％)；混合分型20/115(17.39％)；還有5例

7、(4.35％)缺乏RsaI酶切位點，我們命名為gB5；②CMVgB1型CMV-DNA拷貝數(shù)的中位數(shù)位2.7×103(1.81×103-6.03×104)，gB3型CMV-DNA拷貝數(shù)的中位數(shù)位4.0×103(1.32×103-6.39×104)，混合型CMV-DNA拷貝數(shù)的中位數(shù)位1.2×104(2.28×103-6.50×105)，CMVgB1型和gB3型拷貝數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。單個CMVgB基因型感染(gB1

8、型或gB2型)與混合型感染比較，CMV-DNA拷貝數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；③單個CMVgB感染CMV-DNA轉(zhuǎn)陰中位時間14(7～34)天，混合型CMV-DNA轉(zhuǎn)陰中位時間17(11～42)，單個CMVgB基因型感染與混合感染比較，CMV-DNA轉(zhuǎn)陰時間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；④Logistic回歸模型多因素分析，CMVgB3型感染與CMV肺炎存在相關性(P<0.050)。
　　 第二部分①433對供受

9、體中HLA相合338對，HLA錯配95對，檢出HLA-A位點10個，HLA-B位點23個，HLA-DR位點13個，HLA-C位點8個，HLA-DQ位點5個。HLA-Bw4組和Bw6組分別占46.40％和53.60％，HLA-C1組和C2分別占81.22％和18.78％；②HLA全相合組CMV感染率為45.86％，在HLA全相合移植中，HLA-A24和HLA-DR15等位基因位點在CMV陽性組出現(xiàn)頻率明顯高于CMV陰性組相應的等位基因位點

10、頻率，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.050)。CMV陽性組HLA-Cw6位點出現(xiàn)頻率明顯低于CMV陰性組，差異亦有統(tǒng)計學意義(P<0.050)，Bw4組與Bw6組比較，兩組CMV感染率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。C1與C2組比較兩組CMV感染率差異仍無統(tǒng)計學意義(P>0.050)；③HLA錯配組CMV感染率為63.16％，與HLA全相合比較兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)。單一位點錯配組與2個位點或以上錯配組比較CMV感染率

11、差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)。A位點與C位點錯配是主要的錯配位點，兩組CMV感染率高比較，C位點錯配組CMV感染率高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；④CMV疾病疾病組HLA-A33，HLA-B46，HLA-B58，HLA-DR3，HLA-Cw1位點出現(xiàn)頻率明顯增高，而HLA-Cw6位點出現(xiàn)頻率下降，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；⑤HLA-E基因檢出2種基因型：HLA-E*0101和HLA-E*0103，頻率分別為72

12、.27％和79.83％，HLA-E*0101/0101組CMV感染率高于含HLA-E*0103等位基因組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)。
　　 第三部分①供受體KIR各基因型頻率分布和KIR單體型頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)；②在CMV陽性組供體KIR-Bx單體型中2DS2，KIR-A/A單體型中2DS4*003-007基因出現(xiàn)頻率明顯低于CMV陰性組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.050)，受體KIR各基因出

13、現(xiàn)頻率在CMV陽性組和陰性組無統(tǒng)計學差異(P>0.050)；③供體KIR-B/B單體型組CMV感染率明顯低于供體KIR-A/A單體型，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)，受體KIR各單體型組CMV感染率差異無統(tǒng)計學意義；④多因素分析結果供體攜帶KIR2DS4*003-007基因和供體KIR-B/B單體型是降低CMV感染的有利因素。
　　 第四部分①ACE16內(nèi)含子基因多態(tài)性分布：DD14/128(10.94％)，ID72/128

14、(56.25％)，Ⅱ42/128(38.81％)。CD14-159位基因多態(tài)性分布：CC18/128(14.06％)，CT81/128(63.28％)，TT29/128(22.66％)。MPO-463位點基因多態(tài)性分布：G100/128(78.13％)，GA26/128(20.31％)，A2/128(1.56％)。MBL啟動子-550位基因多態(tài)性分布：H28/128(21.88％)，HL73/128(57.03％)，L27/128(21

15、.09％)。MBL啟動子-221位基因多態(tài)性分布：Y87/128(67.97％)，YX38/128(29.69％)，X3/128(2.34％)；MBL外顯子1區(qū)基因多態(tài)性分布：A94/128(73.44％)，AB32/128(25.00％)，B2/128(1.56％)；②CMV陽性組與CMV陰性組供受體ACE，CD14-159位點，MPO-463位點，MBL啟動子-221以及外顯子1區(qū)基因單核苷酸多態(tài)性差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05

16、0)，CMV陽性組供體MBL-550位點HL基因頻率明顯增高，與CMV陰性組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0，050)。
　　 第五部分①所有92例患者均獲得造血重建，粒系造血重建的中位時間為13天(9～22天)，血小板重建時間為23天(11～45天)。40例患者在移植90天內(nèi)出現(xiàn)CMVpp65陽性，CMVpp65陽性檢出的中位時間為54天(28～84天)；②移植后+30天CMV陽性組CD3+T細胞比例低于CMV陰性組，差異有統(tǒng)計學

17、意義(P<0.050)，+60天，+90天兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。移植后+30天CMV陽性組CD3+CD4+T細胞比例低于CMV陰性組，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)，移植后+60天，+90天兩組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。在移植后90天內(nèi)兩組CD3+CD8+T細胞比例均無統(tǒng)計學差異(P>0.050)。移植后+60天CMV陽性組CD3-CD16+CD56+NK細胞比例高于CMV陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P

18、<0.050)；③在CMV陽性組和陰性組+30天，+60天，+90天淋巴細胞活化標志物CD3+CD25+，CD3+CD69+，CD3+HLA-DR+表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.050)，兩組在移植后+30，+60天CD3-HLA-DR+表達差異亦無統(tǒng)計學意義(P>0.050)，但是移植后+90天，CMV陽性組CD3-HLA-DR+表達低于CMV陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；④CMV陽性組和CMV陰性組NKG2A，NK

19、G2D，NKp30，NKp46，CD158a在移植后+30天，+60天，+90天的表達差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.050)。移植后+60天和+90天，NKG2C在CMV陽性組表達高于CMV陰性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.050)；⑤移植后SOCS1，SOCS3的表達均較正常對照明顯升高，在移植后+60天表達最高，此時SOCS3表達在CMV陽性組較CMV陰性組明顯高(P<0.050)，而SOCS1在兩組中表達沒有差異(P>0.050)。

20、
　　 結論:
　　 1)CMVgB基因分型與CMV病毒載量，抗病毒治療時間和CMV疾病有關，CMVgB3型感染是CMV肺炎的高危因素。
　　 2)HLA錯配是CMV感染的高危因素，HLA相合移植中HLA-A24，HLA-DR15，HLA-Cw6和HLA-E*0101位點與CMV感染相關。
　　 3)激活性KIR基因與造血干細胞移植后CMV感染相關，供體攜帶KIR2DS4*003-007基因和KIR-B/

21、B單體型是降低CMV感染的有利因素。
　　 4)供體MBL基因的單核苷酸多態(tài)性與造血干細胞移植后CMV感染相關。
　　 5)造血干細胞移植后T淋巴細胞重建緩慢，NK細胞持續(xù)高比例存在，NKG2C和SOCS3表達增高與CMV感染相關。
　　 綜上所述，造血干細胞移植后CMV疾病與CMVgB基因多態(tài)性密切相關，移植前對供受體HLA基因型，供體KIR基因型和MBL基因的單核苷酸多態(tài)性分析，移植后監(jiān)測T細胞重建，NK細胞