基于鋅指文庫的Ni2+等金屬離子組合肽篩選與微生物作用研究.pdf

1、社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，一方面極大地提高了人們的物質(zhì)生活水平，同時(shí)也給我們的生存環(huán)境帶來了重大的壓力與挑戰(zhàn)，因重金屬污染帶來的環(huán)境事故與危害，也已引起社會的高度關(guān)注和重視。微生物修復(fù)技術(shù)，作為環(huán)境重金屬治理的一種重要途徑，近年來得到廣泛地研究與進(jìn)展，而基因工程改造的微生物(GMO)是微生物修復(fù)技術(shù)的主要發(fā)展方向。其中的難點(diǎn)和要點(diǎn)是獲得高親和力的重金屬結(jié)合肽（結(jié)合分子）以及篩選和獲得高富集及耐受能力的環(huán)境微生物。鋅指蛋白作為生物體內(nèi)存在的重要

2、轉(zhuǎn)錄因子，一方面參與了胞內(nèi)DNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的多種生理生化過程，同時(shí)也為Zn2+、Ni2+等重金屬結(jié)合肽的獲得提供了重要的生物來源。而重金屬礦區(qū)同時(shí)也為重金屬富集及耐受微生物菌株的獲得提供了天然了菌種資源庫。
　　 本研究是基于實(shí)驗(yàn)室在前期工作中已經(jīng)構(gòu)建好的C2H2型鋅指蛋白為基本骨架構(gòu)建的細(xì)菌限制性肽庫，利用Percoll密度梯度離心分離和篩選Zn2+、Ni2+重金屬結(jié)合肽并測定其序列，然后利用生物信息學(xué)軟件對測得的序列進(jìn)行多重序

3、列比對，進(jìn)一步確定Zn2+、Ni2+的高親和力結(jié)合肽的序列特征;再通過親和力反篩測定以及重金屬吸附含量測定等方法進(jìn)一步確認(rèn)篩選得到的重金屬結(jié)合多肽對Zn2+、Ni2+的高效或?qū)Ｒ恍越Y(jié)合特性。然后在以上工作的基礎(chǔ)上，再分別對Zn2+和Ni2+的金屬結(jié)合肽序列進(jìn)行氨基酸成分分析，以找到這些金屬結(jié)合肽所共有的性質(zhì)和規(guī)律。同時(shí)我們從鎳礦尾礦中分離篩選得到Ni高耐受菌株，并利用相關(guān)的分子生物學(xué)技術(shù)—16SrDNA鑒定方法結(jié)合其生理生化特性對得到的

4、菌株進(jìn)行菌種鑒定。C2H2型鋅指蛋白細(xì)菌限制型隨機(jī)肽庫的篩選的目的是期望能從中獲得Ni等高親和力結(jié)合肽，而從礦區(qū)土壤中篩選耐Ni微生物是為進(jìn)一步工程菌的改造和重金屬修復(fù)提供基礎(chǔ)。
　　 主要研究結(jié)果:
　　 1.從實(shí)驗(yàn)室前期工作中已構(gòu)建好的C2H2型鋅指蛋白細(xì)菌限制性肽庫中篩選得到了19條Zn2+和Ni2+結(jié)合肽。
　　 2.經(jīng)4輪篩選得到的Zn2+結(jié)合肽以及Ni2+結(jié)合肽與金屬離子的結(jié)合能力隨篩選輪數(shù)遞增而增加

5、，P/N值分別可高達(dá)94.6和141.0。通過PAGE電泳測得融合蛋白的大小約為75KD。對P/N值較大的(P/N＞10)展示菌進(jìn)行重金屬吸附測定，發(fā)現(xiàn)展示菌6#和16#對重金屬Ni的吸附能力較好，吸附率均可以達(dá)到50％左右，展示菌5#，17#對重金屬的吸附效果未能達(dá)到理想的效果。
　　 3.經(jīng)過對Zn2+和Ni2+結(jié)合肽序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析后發(fā)現(xiàn)具有以下共有序列特征:-H-X4-H-、-F-X-F-。其中氨基酸Ala、Thr