海洋微生物中細(xì)菌群體感應(yīng)抑制因子的篩選與作用機(jī)制研究.pdf

1、隨著抗菌藥物的廣泛應(yīng)用,細(xì)菌的耐藥性變得越來(lái)越嚴(yán)重,已成為全球關(guān)注的危害人類健康的重大難題。目前臨床上使用的抗生素都是以細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞壁合成、DNA超螺旋等為靶點(diǎn),通過(guò)干擾這些重要生命過(guò)程直接殺死微生物或抑制微生物生長(zhǎng)來(lái)實(shí)現(xiàn)抗感染目的的。在這種生存壓力下,細(xì)菌很容易產(chǎn)生耐藥性。顯然以傳統(tǒng)的靶點(diǎn)和篩選方法獲得的抗生素?zé)o法從根本上解決細(xì)菌的耐藥問(wèn)題。因此,尋找治療細(xì)菌感染的新途徑已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿和熱點(diǎn)。近幾年來(lái),細(xì)菌群體

2、感應(yīng)(Quorum-Sensing,QS)研究的發(fā)展,給我們帶來(lái)了新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。群體感應(yīng)是細(xì)菌根據(jù)細(xì)胞密度變化進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控的一種群體行為。研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌通過(guò)群體感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控致病過(guò)程的一些重要環(huán)節(jié),如致病因子產(chǎn)生、生物膜(Biofilm)形成等。根據(jù)美國(guó)NIH的調(diào)查報(bào)告,80％以上的細(xì)菌性感染與生物膜有關(guān),而生物膜的形成是細(xì)菌產(chǎn)生抗生素耐藥性和免疫逃逸的主要原因之一。因此,細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)干擾的研究對(duì)于新型抗菌藥物的研究與開發(fā)具有重

3、要意義。本文以革蘭氏陰性菌的酰基高絲氨酸內(nèi)酯(N-acyl- homoserine lactones, AHL)介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)為靶標(biāo),從海洋微生物中篩選群體感應(yīng)抑制因子,并對(duì)其活性和作用機(jī)理進(jìn)行研究。綜合利用唯一能源法和報(bào)告菌株法,建立了一種從環(huán)境微生物中快速、高效地篩選能產(chǎn)生AHL群體感應(yīng)抑制因子菌株的方法;利用該方法從海洋微生物中篩選得到多株具有AHL降解能力和競(jìng)爭(zhēng)性抑制AHL群體感應(yīng)能力的細(xì)菌,并對(duì)其中活性最高的一株進(jìn)行了菌種

4、鑒定,命名為Stenotrophomonas sp.A8。構(gòu)建了菌株A8基因組DNA文庫(kù),利用AHL唯一能源培養(yǎng)基從文庫(kù)中篩選得到一個(gè)具有AHL降解活性的克隆,并利用亞克隆試驗(yàn)確定了具有AHL降解酶活性基因的部分讀碼框;進(jìn)一步通過(guò)反向PCR克隆得到該基因全長(zhǎng)序列,最終得到的降解酶AQ1基因序列全長(zhǎng)747bp,編碼248個(gè)氨基酸,分子量為31.2kD。與Pseudomonas aeruginosa中的AHL降解酶PvdQ同源性為12%,與

5、QuiP同源性為13%,可能屬于酰氨酶家族。該酶對(duì)多種不同碳鏈長(zhǎng)度的AHL分子均具有降解活性,尤其對(duì)3OC6HSL降解活性最強(qiáng)。采用層析技術(shù)結(jié)合多種AHL報(bào)告菌株,從A8的發(fā)酵液上清中分離純化了三個(gè)具有AHL競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的化合物,NMR和MS分析表明這三個(gè)化合物均為環(huán)肽,命名為:CP1、CP2和CP3。這三個(gè)化合物都能競(jìng)爭(zhēng)性抑制AHL分子與其受體的結(jié)合;其中,CP2還能夠抑制革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌生物膜的形成;同時(shí)S

6、.aureus RN4220中QS調(diào)控基因agrA、SarA、Hld的定量PCR結(jié)果表明,其mRNA轉(zhuǎn)錄水平均受到CP2的抑制。因此,CP2的抗細(xì)菌生物膜形成作用可能是通過(guò)抑制S.aureus RN4220的QS系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。綜上所述,我們建立了一種高效的從環(huán)境微生物中篩選產(chǎn)生AHL群體感應(yīng)抑制因子菌株的方法;從活性菌株Stenotrophomonas sp.A8中克隆了一個(gè)AHL降解酶基因,其重組酶具有降解多種不同碳鏈長(zhǎng)度AHL分子的

7、活性,該類型的酶在Stenotrophomonas屬細(xì)菌中還未見報(bào)道;同時(shí)還從A8菌株發(fā)酵液上清中分離得到三個(gè)具有AHL競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的環(huán)肽CP1、2和3,首次發(fā)現(xiàn)環(huán)肽化合物CP2對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有顯著抑制作用,并初步證明CP2的抗生物膜作用與QS系統(tǒng)有關(guān)。與傳統(tǒng)的抗生素的作用機(jī)制完全不同,細(xì)菌群體感應(yīng)抑制因子通過(guò)干擾細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)抗感染的目的,而不影響細(xì)菌的生長(zhǎng),因此不會(huì)產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性。