五節(jié)微生物中的轉(zhuǎn)座因子

1、第五節(jié)微生物中的轉(zhuǎn)座因子轉(zhuǎn)座因子（transposableelement，TE）是一類廣泛存在于細菌、病毒和真核生物DNA分子中一段可自主改變自身座位的DNA片段，它可以在同一細胞內(nèi)DNA復制子間轉(zhuǎn)移，也可以在一個復制子內(nèi)部轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)座因子是20世紀40年代由BarbaraMcClintock在進行玉米的遺傳學研究時首先發(fā)現(xiàn)的，她因此而榮獲了1983年度的諾貝爾獎。爾后在細菌中得到了廣泛和深入的研究。轉(zhuǎn)座因子的共同特征是：插入寄主DNA后

2、，導致基因失活；插入時在靶DNA位點產(chǎn)生一個短的正向重復順序。一轉(zhuǎn)座子的發(fā)現(xiàn)和分類轉(zhuǎn)座因子：是基因組內(nèi)一段相對獨立的、可移動序列，它們不必借用噬菌體或質(zhì)粒的形式就可以從基因組的一個部位直接轉(zhuǎn)移到另一個部位，這個過程稱為轉(zhuǎn)（transposition）。轉(zhuǎn)座子每次移動時攜帶著轉(zhuǎn)座必需的基因一起在基因組內(nèi)躍遷，所以轉(zhuǎn)座子又稱跳躍基因（jumpinggene）。轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座特點（1）基因組內(nèi)移動；（2）不依賴于供體與受體間的序列關(guān)系；（3）一

3、般僅移動轉(zhuǎn)座子序列本身。根據(jù)轉(zhuǎn)座因子的轉(zhuǎn)座機理，將轉(zhuǎn)座因子分為兩類：第一類是DNA轉(zhuǎn)座子(DNAtransposon)，其轉(zhuǎn)座過程是從DNA→DNA，這類轉(zhuǎn)座因子存在于原核生物和真核生物中，如細菌的轉(zhuǎn)座子和插入序列；第二類是反轉(zhuǎn)座子(retrotransposon)，其轉(zhuǎn)座過程是以RNA為中間體，即從DNA→RNA→cDNA→DNA轉(zhuǎn)座。二、細菌轉(zhuǎn)座因子的類型和結(jié)構(gòu)細菌轉(zhuǎn)座因子分為四個類型：插入序列（ionsequence，IS）轉(zhuǎn)座子

4、（transposon，Tn）轉(zhuǎn)座噬菌體（Mu）接合型轉(zhuǎn)座子一）、插入序列插入序列也稱IS因子，它是最簡單的轉(zhuǎn)座因子。IS因子的長度一般為0.72.5kb。?最簡單的轉(zhuǎn)座因子，不含任何宿主基因的可轉(zhuǎn)座的DNA序列（ionsequencesIS）。?IS元件是獨立的結(jié)構(gòu)單位，每個元件只編碼為自身轉(zhuǎn)座所需要的蛋白質(zhì)。?IS元件的末端為短的反向末端重復序列（invertedterminalrepeats）。插入序列的結(jié)構(gòu)有以下3個特點：①在I

5、S的兩端含有長度為10～40bp反向重復序列（invertedrepeatsequence，IR），兩端的反向重復序列在IS的切割和DNA鏈轉(zhuǎn)移中起作用。②大多數(shù)IS都含有一個編碼轉(zhuǎn)座酶（Transposnase簡稱Tnp）的長編碼區(qū)，其啟動子位于一端的反向重復序列之內(nèi)，而剛好終止于另一端的反向重復序列之前或之內(nèi)。轉(zhuǎn)座酶負責識別切割轉(zhuǎn)座子的兩端以及在靶位點造成切口。有些IS含有2個或2個以上的開放閱讀框架，它們除編碼轉(zhuǎn)座酶外，還編碼用于

6、調(diào)控轉(zhuǎn)座酶活性的調(diào)節(jié)蛋白。③在IS插入時，在靶DNA位點產(chǎn)生一個短的、長度一般為39bp正向重復順序(directrepeatsequence，DR)，分布在IS的兩側(cè)。?插入位點一般是隨機的，很少是位點專一的。?轉(zhuǎn)座是罕見事件，與自發(fā)突變率處于同一數(shù)量級，約為每代106一107。插入片段精確切離后，可使IS誘發(fā)的突變回復為野生型，但這種概率很低，每代只有106一1010。不精確切離可使插入位置附近的宿主基因發(fā)生缺失。二）、細菌轉(zhuǎn)座子幾

7、乎就在發(fā)現(xiàn)IS因子的同時，微生物學家和遺傳學家注意到細菌中某些對抗抗生素的基因能從一種DNA分子轉(zhuǎn)移到另一種DNA分子。因此，將帶有抗性基因并能在不同的DNA分子之間移動的遺傳單位叫做細菌轉(zhuǎn)座子(bacterialtransposon，Tn)。Tn分子一般在2000~25000bp，兩端反向重復序列Tn與IS的主要區(qū)別是攜帶與轉(zhuǎn)座無關(guān)的藥物抗性或其他特性的基因。Tn一般具有抗生素抗性的基因，因為這些基因容易鑒別，故研究得較為廣泛和深入。

8、?某些Tn的反向重復序列是已知的IS，帶有IS的Tn也稱為復合型轉(zhuǎn)座子，如Tn5、Tn10、Tn903?不含有IS的Tn稱為簡單轉(zhuǎn)座子，如Tn3?沒有IS序列，體積龐大的轉(zhuǎn)座子稱為TnA家族細菌抗藥性轉(zhuǎn)座子一般可分為兩類：復合轉(zhuǎn)座子(compositetransposon)復雜轉(zhuǎn)座子(complextransposon)1.復合轉(zhuǎn)座子：復合轉(zhuǎn)座子是由兩個完全相同或類似的插入序列IS和某種抗藥性基因組成的復合因子，IS作為Tn的兩個臂或稱

9、兩個末端，兩個IS在Tn中做正向或反向排列。在這類轉(zhuǎn)座子中，IS可以帶動整個Tn的轉(zhuǎn)座，也可單獨進行轉(zhuǎn)座。?接合型轉(zhuǎn)座子在切割和整合上類似于轉(zhuǎn)座子，但其機理不同于典型的轉(zhuǎn)座子如Tn5、Tn10：接合型轉(zhuǎn)座子可以形成ccc中間體，且整合部位不產(chǎn)生正向重復序列；?與質(zhì)粒相似，都能形成ccc轉(zhuǎn)移中間體，靠接合作用轉(zhuǎn)移，但不能獨立復制；?切割和整合上類似于溫和噬菌體，其整合酶屬于λ整合酶家族，不同的是不形成病毒顆粒，不依賴于噬菌體進行轉(zhuǎn)移。三、

10、細菌轉(zhuǎn)座因子的遺傳效應和應用一）、轉(zhuǎn)座因子的遺傳效應轉(zhuǎn)座因子能引起許多遺傳變異，如插入突變和基因重排等。1.插入突變：各種IS、Tn都可以引起插入突變。當它們插入到一個基因時，該基因的功能受到破壞，其表型和一般突變體相同，如營養(yǎng)缺陷型、酶活性喪失等。另外，由于Tn總是帶有抗藥性基因，所以轉(zhuǎn)座子插入后除能引起基因突變外，還具有轉(zhuǎn)座子帶來的抗藥性。2.DNA重排(缺失、倒位和擴增)：幾乎所有的轉(zhuǎn)座因子都能促進它們相鄰基因的缺失。當轉(zhuǎn)座因子插

11、入某一基因后，一方面引起該基因的失活，另一方面也引起插入部位鄰近片段的不穩(wěn)定而產(chǎn)生缺失。缺失：當轉(zhuǎn)座子以相同方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，在兩個正向重復轉(zhuǎn)座因子之間發(fā)生同源重組，就導致宿主染色體DNA缺失。倒位：當轉(zhuǎn)座因子以相反方向轉(zhuǎn)座到鄰近位置上，然后發(fā)生重組，則引起染色體DNA倒位。擴增：轉(zhuǎn)座子之間的同源重組，可使兩個不同的DNA片段連接在一起，從而引起DNA的擴增。使一些原來在染色體上相距甚遠的基因組合到一起，形成一個操縱子或表達單元，也

12、可能產(chǎn)生一些具有新的生物學功能的基因和新的蛋白質(zhì)分子。3.極性效應當轉(zhuǎn)座因子插入到一個操縱子的上游基因時，不僅能破壞被插入的基因，而且也能大大降低位于遠離啟動子一端的基因的表達?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)轉(zhuǎn)座因子都有極性效應，而且正、反向插入都有這種現(xiàn)象。幾乎所有IS的可閱讀框內(nèi)(除IS1外)，都含有依賴于Rho的轉(zhuǎn)錄終止信號和終止密碼子，這是造成極性突變的根本原因。極性效應：一個轉(zhuǎn)錄單位中的一個無義突變能抑制轉(zhuǎn)錄單位中隨后基因的轉(zhuǎn)錄。二）、轉(zhuǎn)座

13、子的應用轉(zhuǎn)座子通常在一些被稱為靶序列(targetsequence)的特定序列上插入，這些短序列在基因組上的排列是相對隨機的，它的插入導致被插入基因的突變。因此，可以利用轉(zhuǎn)座子的這一特性進行基因誘變。用于誘變的轉(zhuǎn)座子一般都是復合型轉(zhuǎn)座子，如：Tn5、Tn9、Tn10等，其中用的較多的是Tn5和Tn10。它們的轉(zhuǎn)座頻率高，對目標序列特異性要求低，而且轉(zhuǎn)座子不需要與細菌的基因組存在同源性等優(yōu)點，因而被廣泛用于許多革蘭陰性菌的轉(zhuǎn)座誘變中。利用

14、轉(zhuǎn)座子可進行隨機誘變和定位誘變。1.隨機誘變因為轉(zhuǎn)座子不像質(zhì)粒那樣能獨立存在并自主復制，因此要利用轉(zhuǎn)座子進行誘變時需要先將轉(zhuǎn)座子構(gòu)建在適當?shù)妮d體上，通常所用的載體主要是質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座子載體應具有下面兩個功能：①能通過轉(zhuǎn)化或接合作用導人受體菌②在受體菌中不能自我復制，為自殺型質(zhì)粒載體，以使轉(zhuǎn)座子存在轉(zhuǎn)座壓力，保證通過抗性篩選得到的轉(zhuǎn)化子或接合子都含有轉(zhuǎn)座子。2.定位誘變?定位誘變與隨機誘變的原理類似，但誘變中首先需要將轉(zhuǎn)座子，如Tn5，整合在

15、基因組上。?將要誘變的目的基因克隆到質(zhì)粒如F質(zhì)粒上。?將含有目的基因的F′質(zhì)粒轉(zhuǎn)入基因組已整合有Tn5的大腸桿菌中，再與受體菌雜交進行誘變，最后篩選突變型接合子。3利用Tn5mob質(zhì)粒載體研究質(zhì)粒功能四、酵母中的轉(zhuǎn)座因子酵母轉(zhuǎn)座子Ty（Transposonyeast）與果蠅中的轉(zhuǎn)座子及反轉(zhuǎn)錄病毒原病毒類似，能插入染色體的許多位點，在插入的Ty兩端靶基因產(chǎn)生5bp重復。Ty的轉(zhuǎn)座效率比細菌轉(zhuǎn)座子要低，約為107108。釀酒酵母中只有Ty因

16、子，而無其它種類的轉(zhuǎn)座子。酵母菌是低等真核生物，其轉(zhuǎn)座子類似于細菌轉(zhuǎn)座子。酵母轉(zhuǎn)座子中研究較清楚的是Ty類轉(zhuǎn)座子：如TY1和TY917。TY結(jié)構(gòu)：含約5.6kb中心區(qū)，都有分布于兩端的340bp的同向重復序列(稱為δ)，其作用與IS、Tn中的反向重復序列類似。每個單倍體酵母基因組有3035個TY，及至少100個單一的δ因子(soloδelements)。Ty1轉(zhuǎn)座因子是通過一種RNA中間產(chǎn)物進行的。首先以其DNA為模板合成一個拷貝的RN

17、A；然后再通過反轉(zhuǎn)錄合成一條新的Ty1因子；最后這條新的Ty1轉(zhuǎn)座子再插入到新的位點上一）、Ty因子在酵母基因組中的分布情況釀酒酵母中有5類反轉(zhuǎn)座子，即Ty1Ty5，Ty插入占整個基因組的3.1%，其中主要是單個LTR（soloLTR），是由于LTRLTR間的重組使Ty中間區(qū)缺少后產(chǎn)生的。二、Ty因子的分子結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄?酵母中5類轉(zhuǎn)座子的結(jié)構(gòu)基本相同，每一結(jié)構(gòu)單位約6.3kb，兩端是約330bp的長末端正向重復序列LTR，中間是2個FTy

18、A和TyB；?TyA類似于反轉(zhuǎn)錄病毒的gag，編碼結(jié)構(gòu)蛋白，如核酸結(jié)合蛋白（NA）；TyB類似于pol，編碼參與反轉(zhuǎn)錄的酶蛋白，如蛋白酶、整合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNase等。?Ty因子從左側(cè)LTR結(jié)構(gòu)的啟動子內(nèi)開始轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄出兩種mRNA：5kb、5.7kb（終止于右側(cè)的LTR內(nèi)）。?TyA和TyB以兩種方式表達：TyA蛋白代表TyA可讀框；TyB只有連接蛋白（TyATyB）的一部分被表達。Ty因子與反轉(zhuǎn)錄病毒非常相似（1）二者之間的分子結(jié)

19、構(gòu)非常相似，如均有長末端重復序列LTR；它們轉(zhuǎn)錄和翻譯的方式也很類似。（2）轉(zhuǎn)座是由Ty因子內(nèi)的基因控制的，且要經(jīng)過一個RNA階段。（3）雖然Ty因子不產(chǎn)生感染顆粒，但在經(jīng)誘導發(fā)生轉(zhuǎn)座的細胞中存在著Ty病毒樣顆粒（VLPsViruslikeparticles）（4）僅有某些Ty因子在任何酵母基因組中都有活性，大部分沒有轉(zhuǎn)座能力，此和惰性的內(nèi)源性前病毒相似。（5）反轉(zhuǎn)錄病毒首先被觀察到的是以傳染性病毒顆粒的形式存在，并能在細胞間傳播；而反