對蝦抗病微生物的篩選及其作用機制的研究.pdf

1、益生菌是公認的安全有效的對蝦免疫增強物質(zhì),同時也是控制對蝦病害的主要策略之一,目前欠缺的是對新型高效的功能性菌株的篩選和應用研究。本研究是以分離自健康對蝦消化道和養(yǎng)殖環(huán)境的幾株優(yōu)勢菌為研究對象,在考察它們抗WSSV感染效果的基礎上,進一步分析了堅強芽孢桿菌PC024和溶藻膠弧菌LV463添加到對蝦飼料中,對養(yǎng)殖對蝦免疫酶活性、免疫相關(guān)分子表達水平以及對WSSV在對蝦體內(nèi)的增殖速率的影響。本研究取得了堅強芽孢桿菌活菌與溶藻弧菌活菌配合使用

2、可顯著提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力;抗病菌株通過提高對蝦免疫水平和抗病基因表達來減緩病毒在對蝦體內(nèi)的增殖,從而發(fā)揮抗病毒保護作用等重要結(jié)果。本研究篩選的菌株可望以飼料添加劑的方式應用于對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn),成為對蝦白斑病生態(tài)防治的有效途徑之一。主要研究內(nèi)容和結(jié)果分以下幾方面:
　　1、海水細菌主要鑒定方法的應用與比較。為了尋求快速準確地鑒定細菌的方法,本實驗同時采用16S Rrna基因序列分析法、細菌脂肪酸氣相色譜法、ATB微生物鑒

3、定系統(tǒng)、Biolog微生物自動鑒定系統(tǒng)4種方法對分離自健康對蝦腸道和養(yǎng)殖海水的。T6株海水細菌進行鑒定。結(jié)果顯示:16S rRNA序列分析和細菌脂肪酸氣相色譜法比ATB法和Biolog法鑒定步驟簡單,且鑒定成本低;16S rRNA序列分析和ATB法鑒定到種的準確率遠高于Biolog法和細菌脂肪酸氣相色譜法。在具體的實踐中可根據(jù)實驗要求和設備條件選擇合適的細菌鑒定方法,也可以將不同的方法結(jié)合起來得到更加準確的鑒定結(jié)果。
　　2、一株

4、海水芽孢桿菌的鑒定與生物學特性分析。從健康中國對蝦養(yǎng)殖海水中分離純化一株優(yōu)勢菌,編號為PC024,形態(tài)學觀察和革蘭氏染色說明該菌株為革蘭氏陽性菌,2216E培養(yǎng)基培養(yǎng)24h的菌落呈圓形、中間略微凸起,直徑約為2mm,細胞呈桿狀,端生芽孢,周生鞭毛。經(jīng)Biolog碳源利用反應、脂肪酸氣相色譜分析得出該菌株與堅強芽孢桿菌的生理生化特性最相近;16SrRNA序列測定表明與芽孢桿菌屬中幾株菌的同源性均達到100％以上,在分子進化樹中該菌株與堅強

5、芽孢桿菌(Bacillus firmus)的進化地位最接近。綜合16S rRNA基因序列分析、ATB微生物自動鑒定系統(tǒng)、BIOLOG微生物自動鑒定系統(tǒng)和細菌脂肪酸氣相色譜四種方法的鑒定結(jié)果,將該菌株鑒定為堅強芽孢桿菌。
　　3、4株共生菌單一或復合菌株對凡納濱對蝦抗WSSV感染力的影響。將堅強芽孢桿菌PC024,蠟樣芽孢桿菌PC465,溶藻弧菌LV463和PC773活菌/滅活菌單一或組合后分別包裹于飼料中應用到凡納濱對蝦(Lito

6、penaeus vannamei)的養(yǎng)殖,投喂20 d后,用WSSV進行肌肉注射攻毒,感染14 d后統(tǒng)計每個實驗組的累積死亡率。從感染實驗結(jié)果看出:堅強芽孢桿菌/溶藻弧菌復合組(B/V組)的累積死亡率顯著低于其他各實驗組和對照組(P<0.05)。飼喂含有堅強芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、兩株溶藻弧菌的飼料均可顯著提高凡納濱對蝦抗WSSV感染的能力,且堅強芽孢桿菌與溶藻弧菌配合使用的效果最佳。
　　4、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦免疫相關(guān)

7、酶活性的影響。以兩種實驗飼料(芽孢桿菌單一菌組、芽孢桿菌/滅活溶藻弧菌組)和基礎飼料,對凡納濱對蝦進行了為期35 d的養(yǎng)殖實驗。養(yǎng)殖期間每5 d取樣,分析益生菌對對蝦血清和肝胰腺主要免疫酶活性的影響。結(jié)果顯示:免疫期間和感染W(wǎng)SSV期間各實驗組對蝦血清和肝胰腺的酸性磷酸酶活性(ACP)、總超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(L,ZM)、過氧化氫酶(POD)、酚氧化酶(PO)等相關(guān)免疫酶活性和蛋白含量較對照組顯著增加(P<0.05)。結(jié)果提

8、示:益生菌的補充可增強對蝦免疫功能,從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　5、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦血淋巴免疫相關(guān)分子表達水平的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,養(yǎng)殖期間每5d取樣,分析益生菌對對蝦血淋巴酚氧化酶原(proPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、溶菌酶(LZM)、熱休克蛋白70(HSP70)、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(LGBP)、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白(βGB

9、P)七種免疫相關(guān)基因的mRNA的表達量的影響。Real-time PCR的結(jié)果顯示:免疫期間各基因總體上均顯著高于對照組(P<0.05);病毒感染期間7種基因均呈先上調(diào)達到最大值后在下降的趨勢。結(jié)果提示:益生菌的補充可激活對蝦血淋巴免疫相關(guān)分子的表達,從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　6、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦類淋巴免疫相關(guān)分子表達水平的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,分析芽孢桿菌/溶藻弧菌組免疫期間和攻毒感染后

10、類淋巴中溶菌酶、酚氧化酶原、超氧化物歧化酶、熱休克蛋白70、脂多糖-β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白、信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子和β-1,3-葡聚糖結(jié)合蛋白七種免疫相關(guān)基因的mRNA的表達量變化。Real-time PCR結(jié)果顯示免疫期間該組對蝦類淋巴中七種基因的相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05);感染期間,除HSP70和STAT基因相對表達量在整個感染階段變化不明顯外,其他5種基因均呈先上調(diào)達到最大值又下降趨勢。結(jié)果提示:益生菌的補充可

11、激活對蝦類淋巴免疫相關(guān)分子的表達,從而提高對蝦抗WSSV感染的能力。
　　7、飼料中添加益生菌對凡納濱對蝦感染W(wǎng)SSV后病毒增殖速率的影響。飼料的制備與對蝦的養(yǎng)殖同第3章,利用絕對定量PCR技術(shù)檢測各實驗組和對照組攻毒后不同時間對蝦肌肉和鰓組織中WSSV病毒拷貝數(shù)。結(jié)果表明,飼料中添加益生菌的各個實驗組的WSSV病毒拷貝數(shù),在各個取樣時間點均顯著低于對照組(P<0.05)。結(jié)果提示:益生菌的補充可降低對蝦感染W(wǎng)SSV后病毒在對蝦體