負(fù)性共刺激分子B7H1和B7H4在不同發(fā)育階段小鼠腸組織的表達(dá)及其在腸輻射損傷中的作用.pdf

1、腸上皮組織作為機(jī)體的防御屏障之一，對(duì)抵御病原體及有害因子入侵起著重要作用。小腸上皮細(xì)胞更新迅速，對(duì)電離輻射十分敏感，由此造成的小腸結(jié)構(gòu)和功能損傷的確切機(jī)制尚不清楚，從而制約了腸道輻射損傷的救治，也是腹部腫瘤放射治療領(lǐng)域研究的重要課題。業(yè)已表明，電離輻射造成的腸隱窩干細(xì)胞及其干細(xì)胞龕損傷是腸損傷難以救治的關(guān)鍵機(jī)制。盡管目前已發(fā)現(xiàn)多種防護(hù)藥物，如TLRs激動(dòng)劑等，但如何維持腸區(qū)域穩(wěn)態(tài)和保護(hù)腸干細(xì)胞機(jī)制尚不明了。
　　共刺激分子及其介導(dǎo)

2、的共刺激分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)在免疫應(yīng)答中起到了至關(guān)重要的作用。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)了一群介導(dǎo)免疫下調(diào)的負(fù)性分子，稱(chēng)之為免疫卡控點(diǎn)(Immune Checkpoints)，包括B7H1、B7H3、B7H4等，起到維持免疫穩(wěn)態(tài)為主的調(diào)節(jié)作用，并已證實(shí)可表達(dá)于多種免疫細(xì)胞及腫瘤組織中，介導(dǎo)腫瘤的免疫逃逸。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)小腸組織表達(dá)B7H1和B7H4分子，但具體作用尚不清楚。鑒于此，本文以B7H1和B7H4分子在不同發(fā)育階段小鼠腸道的表達(dá)規(guī)律及

3、其與干細(xì)胞的相關(guān)性為研究基礎(chǔ)，建立不同劑量照射造成的腸損傷模型，并采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，觀測(cè)B7H1和B7H4分子在輻射損傷不同階段腸組織中的表達(dá)及對(duì)干細(xì)胞的影響，以探討輻射性腸損傷的生物學(xué)機(jī)制并尋找新的干預(yù)措施。
　　第一部分 B7H1和B7H4分子在小鼠不同發(fā)育階段腸組織的表達(dá)
　　目的:分析B7H1和B7H4分子在C57BL/6J和Lgr5-EGFP-ires-CreERT2小鼠不同發(fā)育階段腸

4、道中的表達(dá)規(guī)律及其與腸干細(xì)胞的相關(guān)性。
　　方法:分別取出生0w、1w、3w、6w、9w小鼠小腸和大腸，通過(guò)免疫組化觀察B7H1和B7H4分子表達(dá)水平，進(jìn)而通過(guò)免疫熒光探究其表達(dá)位置；并采用Lgr5-EGFP-ires-CreERT2轉(zhuǎn)基因小鼠觀察B7H1和B7H4分子的表達(dá)與Lgr5干細(xì)胞存在何種相關(guān)性；
　　結(jié)果:(1)B7H1和B7H4分子均自3 w開(kāi)始表達(dá)于小腸(空腸、回腸)隱窩底部；(2)免疫熒光表明B7H1位于潘

5、氏細(xì)胞內(nèi)，B7H4位于潘氏細(xì)胞胞膜上，兩者均不表達(dá)于Lgr5干細(xì)胞中；(3)結(jié)直腸組織未見(jiàn)B7H1和B7H4分子表達(dá)。
　　結(jié)論:本部分研究分別采用野生型C57和Lgr5-EGFP小鼠，明確了B7H1和B7H4分子在腸道表達(dá)的規(guī)律及表達(dá)位置，從而為下一步的研究奠定了基礎(chǔ)。
　　第二部分B7H1和B7H4分子在輻射性腸損傷中的表達(dá)及意義
　　目的:建立不同劑量照射所致的腸損傷模型，觀察B7H1和B7H4分子的表達(dá)及其與腸

6、損傷的相關(guān)性。
　　方法:將6~8 w C57BL/6J小鼠分為對(duì)照、2 Gy、5 Gy、8 Gy、11 Gy照射組，給予照射組小鼠200 cGy/min的X射線(xiàn)全身照射，取照后不同時(shí)間點(diǎn)（6 h、1 d、3 d、5 d、7 d、10 d、14 d）的小鼠空、回腸樣本，通過(guò)HE染色觀察小腸損傷程度；通過(guò)免疫組化和免疫熒光觀察正常和受照小腸中B7H1和B7H4的表達(dá)水平變化。
　　結(jié)果:(1)2 Gy和5 Gy照射后3~5 d

7、小腸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，至7 d結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)正常，但5 Gy照射組恢復(fù)緩慢；8 Gy照射后小鼠存活時(shí)間縮短；小腸損傷7 d開(kāi)始恢復(fù)；11 Gy照射后3 d小鼠全部死亡，呈現(xiàn)不可逆性損傷；(2)2 Gy照射后B7H1和B7H4分子在小腸隱窩組織表達(dá)未見(jiàn)明顯變化；5 Gy照射3 d后B7H1分子小腸隱窩組織潘氏細(xì)胞的表達(dá)下降，但隨著小腸上皮損傷修復(fù)時(shí)(7 d)還呈現(xiàn)表達(dá)，B7H4分子在照射后5 d表達(dá)減少，未能見(jiàn)恢復(fù)性表達(dá)；(3)大劑量(8、11

8、 Gy)照射后1~3 d時(shí)B7H1和B7H4分子在小腸組織的表達(dá)明顯減少，由于大劑量照射所導(dǎo)致小鼠全部死亡，未能觀察到B7H1和B7H4分子表達(dá)的進(jìn)一步變化。
　　結(jié)論:分別建立了不同劑量照射所造成的腸損傷模型，明確了小劑量照射后B7H1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)的恢復(fù)而逐漸表達(dá)，同時(shí)明確了B7H4分子在5 Gy照射后未能恢復(fù)性表達(dá)，確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步的探討；大劑量照射后B7H1和B7H4分子明顯減少，小腸損傷不可逆，表明免疫卡控點(diǎn)參

9、與輻射所致腸穩(wěn)態(tài)失衡及損傷修復(fù)過(guò)程。
　　第三部分 B7H1和B7H4分子在TLR5激動(dòng)劑CBLB502對(duì)輻射性腸損傷防護(hù)中的作用
　　目的:采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502對(duì)不同劑量造成的腸損傷進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，觀察B7H1和B7H4分子的表達(dá)變化及其對(duì)干細(xì)胞的作用。
　　方法:將Lgr5-EGFP小鼠及C57BL/6J小鼠分為對(duì)照、照射組及CBLB502照射組，通過(guò)免疫熒光和Western Blotting檢測(cè)小腸干

10、細(xì)胞凋亡、增殖、B7H1和B7H4分子的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)照射前0.5 h腹腔注射CBLB502可使7 Gy X射線(xiàn)照射小鼠全部存活，明顯提高9 Gy、10 Gy全身照射小鼠的存活率和體重；(2)照射前0.5 h注射CBLB502明顯減少小腸上皮細(xì)胞及干細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖。(3)照射前0.5 h注射CBLB502顯著地上調(diào)B7H1和B7H4分子在潘氏細(xì)胞中的表達(dá)，與腸輻射損傷存在相關(guān)性。
　　結(jié)論:證實(shí)了照射前

11、0.5 h采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502對(duì)不同劑量照射所造成的腸損傷進(jìn)行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達(dá)，提示CBLB502對(duì)腸輻射損傷的防護(hù)可能與上調(diào)表達(dá)B7H1和B7H4分子，維護(hù)組織穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)損傷修復(fù)相關(guān)。
　　綜上所述，本文明確了B7H1和B7H4分子在發(fā)育不同階段小鼠腸道的表達(dá)規(guī)律及其與干細(xì)胞的相關(guān)性。并在此基礎(chǔ)上建立了不同劑量照射造成的腸損傷模型，繼而采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502進(jìn)行預(yù)防性干預(yù)，觀測(cè)到小劑量

12、照射后B7H1逐漸減少并隨小腸結(jié)構(gòu)恢復(fù)逐漸表達(dá)，而B(niǎo)7H4分子在5 Gy照射后未能恢復(fù)性表達(dá)，大劑量照射后B7H1和B7H4分子明顯減少，小腸損傷不可逆。采用TLR5激動(dòng)劑CBLB502對(duì)不同劑量照射所造成的腸損傷進(jìn)行干預(yù)可上調(diào)B7H1和B7H4分子的表達(dá)，提示CBLB502對(duì)腸輻射損傷的防護(hù)可能通過(guò)上調(diào)表達(dá)B7H1和B7H4分子，明顯減少小腸上皮細(xì)胞及干細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)其增殖從而提高照射小鼠的存活率和體重?？梢?jiàn)負(fù)性共刺激分子B7H1和