瘤胃古菌C簇的分布、分離及氫營養(yǎng)特性的研究.pdf

1、甲烷是瘤胃微生物的代謝終產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生不但是反芻動物能量損失，還是溫室氣體的主要來源，因此對瘤胃甲烷菌的研究成為當前熱點。瘤胃古菌C簇(RCC)可能是一個新的瘤胃甲烷菌目，但目前尚未有直接的證據(jù)。為證實RCC是甲烷菌，本文嘗試采用與厭氧真菌共培養(yǎng)的方法，從瘤胃液中富集培養(yǎng)RCC菌株;通過體外共培養(yǎng)模型研究它們的代謝特點及富集培養(yǎng)條件;利用熒光定量PCR研究它們在瘤胃內(nèi)的分布以及它們在飼喂不同精粗比日糧的山羊瘤胃中的變化情況。實驗共分

2、五個部分:
　　 1 RCC菌株LGM在厭氧真菌培養(yǎng)液中的豐度及其在山羊瘤胃不同部位的分布
　　 本研究建立了RCC菌株LGM的熒光定量PCR方法，對存在于厭氧真菌富集培養(yǎng)液以及瘤胃不同部位樣品中的LGM進行了定量分析。結(jié)果顯示LGM在每五天傳一代的厭氧真菌富集培養(yǎng)液中占總甲烷菌的比例最大(P＜0.05)，在每三天傳一代的厭氧真菌富集培養(yǎng)液中LGM隨著傳代的進行逐漸消失。對瘤胃上皮粘膜、瘤胃內(nèi)容物液相和固相樣品的檢測結(jié)果

3、顯示LGM在瘤胃內(nèi)容物液相中占總甲烷菌的比例最高（為1.34％，P＜0.05）。結(jié)論:對LGM的體外富集培養(yǎng)可采用瘤胃液作為接種物并采用每五天傳一代的傳代頻率。
　　 2厭氧真菌和甲烷菌共培養(yǎng)物的分離
　　 利用富集培養(yǎng)方法和厭氧滾管技術(shù)從山羊瘤胃液中分離純化厭氧真菌與甲烷菌共培養(yǎng)物。經(jīng)過短期傳代富集培養(yǎng)和厭氧滾管挑菌，成功分離到了產(chǎn)甲烷的厭氧真菌培養(yǎng)物，PCR檢測結(jié)果顯示沒有獲得含有LGM的厭氧真菌培養(yǎng)物。形態(tài)學(xué)觀察與

4、細胞核DAPI染色結(jié)果顯示培養(yǎng)物中的厭氧真菌均屬于Piromyces。對培養(yǎng)物中的甲烷菌進行PCR-DGGE和16S rRNA基因序列分析，結(jié)果顯示每個培養(yǎng)物中僅含有一株甲烷菌，并且這些甲烷菌均屬于甲烷短桿菌。下面對培養(yǎng)物F1進行了進一步研究。熒光顯微鏡和掃描電鏡觀察結(jié)果顯示在培養(yǎng)物F1中，甲烷菌附著在厭氧真菌的假根部。利用長期傳代富集培養(yǎng)方法和厭氧滾管挑菌技術(shù)并結(jié)合甲烷短桿菌抑制劑的使用分離得到含有LGM的厭氧真菌培養(yǎng)物，測序結(jié)果顯示

5、LGM含有甲烷菌合成甲烷的關(guān)鍵酶基因（甲基輔酶M還原酶A）。結(jié)論:共培養(yǎng)方法可以分離純化含有未培養(yǎng)甲烷菌的厭氧真菌培養(yǎng)物。
　　 3共培養(yǎng)方法研究瘤胃RCC菌株MGC氫營養(yǎng)特性
　　 本研究利用體外共培養(yǎng)模型研究了雞源RCC菌株MGC的氫營養(yǎng)特性。首先建立起含有白色瘤胃球菌（R.albus）和甲烷菌（甲烷短桿菌或MGC）的體外共培養(yǎng)模型并對模型進行驗證，結(jié)果顯示甲烷菌的生長未對R.albus的代謝產(chǎn)生顯著影響。模型成功建

6、立后，首先對MGC的底物利用特點進行了研究，發(fā)酵結(jié)果顯示在甲醇和三甲胺同時存在的情況下，MGC首先利用三甲胺。接下來利用模型對MGC的氫氣競爭能力進行了研究。在模型中引入一株甲烷短桿菌（M.smithii）與MGC進行氫氣競爭，結(jié)果顯示在模型中MGC的生長延滯期比M.smithii長，M.smithii在MGC的生長延滯期結(jié)束之前就幾乎將R.albus產(chǎn)生的氫氣利用完畢。然而，在低pH模型中，雖然MGC的生長延滯期較長，但它卻在發(fā)酵過程

7、中獲得了絕大部分氫氣，暗示MGC比M.smithii更耐受低pH.降低R.albus在發(fā)酵前期的氫氣產(chǎn)生速度后，MGC獲得了比M.smithii更多的氫氣(67.8％)，暗示MGC在低氫分壓下具有較強的氫氣競爭能力。為了進一步研究MGC的氫氣競爭能力，本研究進行了下列實驗。對氫氣競爭模型進行連續(xù)傳代，結(jié)果顯示隨著傳代的進行總甲烷產(chǎn)量逐漸升高，然而M.smithii在模型中的菌體數(shù)量卻在逐漸降低，這暗示MGC在競爭中占據(jù)了優(yōu)勢并壓制了M.

8、smithii的生長。將MGC接種到從瘤胃液中直接富集的混合細菌和甲烷菌培養(yǎng)物Mix中，發(fā)現(xiàn)MGC不但能夠在Mix中存活，還能夠大量繁殖菌體。結(jié)論:在低氫分壓和甲基化合物充足的條件下，MGC具有較強的氫氣競爭力。此外體外共培養(yǎng)模型為研究瘤胃甲烷菌提供了一條新途徑。
　　 4 RCC富集培養(yǎng)條件的研究
　　 本研究通過在體外共培養(yǎng)模型中添加甲基化合物富集瘤胃液中的RCC菌株。研究結(jié)果顯示雖然在富集傳代過程中產(chǎn)生了大量的甲烷

9、，但培養(yǎng)液中的RCC不但沒有富集反而大幅度降低。化合物L(fēng)umazine的添加并沒有抑制甲烷短桿菌的生長，甲烷短桿菌的數(shù)量在培養(yǎng)液中始終維持在較高水平。將富集的產(chǎn)甲烷培養(yǎng)物接種到BJ培養(yǎng)基（無二氧化碳和碳酸氫鈉）中，由于沒有底物二氧化碳甲烷短桿菌的生長會受到抑制。結(jié)果顯示用甲胺富集的培養(yǎng)物在BJ培養(yǎng)基中很快就沒有甲烷產(chǎn)生，而用甲醇富集的培養(yǎng)物在BJ培養(yǎng)基中甲烷產(chǎn)量逐漸升高并趨于穩(wěn)定。加入萬古霉素處理后，鏡檢顯示培養(yǎng)液中均是球形菌并有F42

10、0自發(fā)熒光。底物利用實驗顯示這些球形菌僅利用氫氣還原甲醇生成甲烷。挑取克隆測序發(fā)現(xiàn)這些球形菌均是甲烷球形菌。結(jié)論:僅在體外共培養(yǎng)模型中添加甲基化合物不能富集RCC菌株。
　　 5不同精粗比日糧對山羊瘤胃內(nèi)RCC豐度的影響
　　 本研究利用熒光定量PCR研究了不同精粗比日糧對山羊瘤胃中RCC豐度的影響。研究發(fā)現(xiàn)不同精粗比日糧對山羊瘤胃內(nèi)容物、瘤胃粘膜、盲腸內(nèi)容物和盲腸粘膜中的總古菌數(shù)量沒有顯著影響(P＞0.05)。飼喂高精