基于豬CCR1和CCR5受體高通量細胞篩選模型的構建及其條件優(yōu)化.pdf

1、趨化因子受體1(chemokine receptor1，CCR1)和趨化因子受體5(chemokine receptor5，CCR5)屬于G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員，可由單核細胞、T細胞、自然殺傷細胞、成纖維細胞等分泌，在心臟、腦、呼吸道、生殖器官等均有表達。研究表明CCR1和CCR5與其配體作用在機體呼吸道系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和生長發(fā)育中均發(fā)揮著重要作用。CCR1和CCR5的共用配體RANTES為CC型趨化因子，RANTES在病毒感

2、染時表現(xiàn)活躍，某些病原影響RANTES表達的機制也初步被闡明。但是在豬方面，關于RANTES與其受體CCR1和CCR5作用后，細胞內信號激活情況如何以及是否能影響某些病毒病的感染過程尚未見報道。
　　為了探究RANTES與豬CCR1和CCR5作用后細胞內信號激活情況，尋找作用CCR1或CCR5的活性化合物，以及其是否能在豬傳染性疾病中起到作用，本研究通過對豬CCR1和豬CCR5進行分子克隆并構建了真核表達載體，在獲得pcDNA3.

3、1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5后，分別轉染HEK293T細胞，通過雙熒光素酶報告基因法，使用微孔板多功能熒光素酶檢測儀檢測RANTES作用后熒光素酶的表達量。根據(jù)檢測結果選擇報告基因與CCR1或CCR5轉染CHO-K1細胞，使用G418和潮霉素B加壓篩選，通過有限稀釋法和單熒光素酶報告系統(tǒng)檢測熒光素酶熒光值的變化情況，篩選出穩(wěn)定表達的CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1單克

4、隆細胞。為了尋找CCR1和CCR5的活性化合物，對能影響高通量篩選過程中CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1熒光素酶表達量的各個條件進行了優(yōu)化。全文主要成果如下:
　　1、使用PCR技術從豬的肌肉組織中擴增出1062bp的CCR1基因片段和1059bp的CCR5基因片段。將豬CCR1和CCR5基因連接到真核表達載體pcDNA3.1(+)并獲得重組質粒pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.

5、1(+)-myc/CCR5。
　　2、將pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重組質粒轉染到HEK293T細胞中，通過RT-PCR技術和Western blotting技術鑒定目的基因的轉錄和翻譯，結果顯示目的基因順利表達。
　　3、將pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重組質粒分別與pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]或p

6、GL4.33[luc2P/SRE/Hygro]和pGL4.74[hRluc/TK]共轉染到 HEK293T細胞中，預先加入Forskolin或不加刺激2h后，加入RANTES作用6h收集細胞，檢測熒光素酶的表達量，根據(jù)熒光素酶表達量變化間接反映出配體作用后對細胞內CRE元件和SRE元件的激活情況，結果發(fā)現(xiàn)RANTES作用于CCR5對CRE和SRE均表現(xiàn)激活效應，作用于CCR1對SRE激活，而對CRE表現(xiàn)出抑制效應;
　　4、分別轉

7、染pcDNA3.1(+)-myc/CCR1與pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]，pcDNA3.1(+)-myc/CCR5與pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]重組質粒到CHO-K1細胞中，通過G418和潮霉素B加壓篩選，有限稀釋法進行單克隆和配體結合試驗，獲得穩(wěn)定表達目的基因的細胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1;
　　5、對目的基因細胞模型高通量篩選條件進行優(yōu)化，結果C