偽狂犬病毒和豬傳染性胃腸炎病毒誘導(dǎo)β干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究.pdf

1、病毒感染與宿主免疫的機(jī)制是當(dāng)今病毒學(xué)研究最重要的前沿領(lǐng)域之一。病毒感染宿主細(xì)胞時(shí),細(xì)胞表達(dá)的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs)識(shí)別和遞呈病毒的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),經(jīng)一系列的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最終誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)等細(xì)胞因子的表達(dá)。從感染細(xì)胞分泌的IFN-Ⅰ與細(xì)胞膜上IFN-Ⅰ共有的受體結(jié)合后,激活相

2、應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),誘導(dǎo)其他抗病毒蛋白與免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá),從而抑制病毒的復(fù)制與傳播,并激活獲得性免疫系統(tǒng)進(jìn)一步清除入侵的病毒,在機(jī)體的抗病毒過程中起重要作用。
　　 盡管近年來的研究初步揭示了病毒感染誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生的過程,但仍有很多未知的問題有待進(jìn)一步探討。例如,新發(fā)現(xiàn)的識(shí)別DNA和RNA的信號(hào)蛋白識(shí)別病毒并誘導(dǎo)IFN—Ⅰ的分子機(jī)制還不清楚,而細(xì)胞中是否還存在其它可以激活I(lǐng)FN-Ⅰ的蛋白,DNA病毒的識(shí)別受體及其介導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)

3、生的機(jī)制是什么等等。因?yàn)榫哂械统杀竞透呦嗨菩缘忍攸c(diǎn),豬的免疫系統(tǒng)逐漸成為人體免疫機(jī)制研究的模型。為了揭示病毒感染豬源細(xì)胞后誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生的分子機(jī)制,本研究從豬源細(xì)胞中克隆了2個(gè)參與天然免疫的重要細(xì)胞信號(hào)分子,并分別以偽狂犬病毒(Pseudorabies Virus,PRV)和豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus,TGEV)為DNA病毒和RNA病毒的模型對(duì)其感染細(xì)胞后的天然免疫反應(yīng)

4、信號(hào)通路進(jìn)行了研究。具體內(nèi)容如下:
　　 1.豬DAI基因的克隆及其功能鑒定DAI(DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors)是被發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)dsDNA誘導(dǎo)天然免疫的受體蛋白,但研究發(fā)現(xiàn)DAI的作用可能存在細(xì)胞特異性和種屬特異性。為此根據(jù)與人DAI基因有較高同源性的豬基因組序列設(shè)計(jì)引物,以豬外周血單核細(xì)胞的RNA為模板克隆得到豬DAI全長(zhǎng)cDNA。序列分析表明,

5、豬DAI開放閱讀框全長(zhǎng)為1320bp(GenBank收錄號(hào):FJ455510),編碼439個(gè)氨基酸。進(jìn)一步對(duì)推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),豬DAI基因編碼蛋白結(jié)構(gòu)域和人、牛、鼠一樣,其N端都具有兩個(gè)DNA結(jié)合區(qū)。組織表達(dá)譜分析表明豬DAI mRNA主要表達(dá)于脾臟、肺臟、腎臟和小腸中。為了分析豬DAI是否能誘導(dǎo)Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生,采用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在不同豬源細(xì)胞中超表達(dá)豬DAI均能在不同程度上激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3(interfer

6、on regulatory factor3)和NF-κB(nuclear factor-kappaB),并誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生,其DNA結(jié)合區(qū)和C端對(duì)激活I(lǐng)FN-β都是非常重要的。而通過RNA干擾技術(shù)把豬DAI沉默后則顯著抑制dsDNA和PRV誘導(dǎo)的IFN-β。這些結(jié)果提示DAI是豬天然免疫系統(tǒng)中的一個(gè)dsDNA的模式識(shí)別受體,在Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)的信號(hào)通路中具有重要作用。
　　 2.豬STNG基因的克隆及其功能鑒定繼DAI后,國(guó)際

7、上三個(gè)研究小組幾乎同時(shí)報(bào)道了另一個(gè)參與細(xì)胞內(nèi)dsDNA誘導(dǎo)IFN-Ⅰ表達(dá)的信號(hào)分子-STING(stimulator of interferon genes),但不同研究對(duì)STING的亞細(xì)胞定位及其在dsRNA和RNA病毒誘導(dǎo)IFN-Ⅰ中的作用存在著分歧。根據(jù)與人STING基因序列有較高同源性的豬EST序列進(jìn)行拼接并設(shè)計(jì)引物,從豬外周血單核細(xì)胞中擴(kuò)增并獲得豬STING全長(zhǎng)cDNA。序列分析表明,豬STING開放閱讀框全長(zhǎng)為1137bp(

8、GenBank收錄號(hào):FJ455509),編碼378個(gè)氨基酸,含有1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列。通過組織表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)豬STING主要表達(dá)于脾臟、淋巴結(jié)和肺臟中。結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明豬STING含有4個(gè)跨膜區(qū),利用綠熒光蛋白做標(biāo)記進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)其主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),但也有部分定位于線粒體。超表達(dá)豬STING能有效激活轉(zhuǎn)錄因子IRF3和NF-κB,并誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生。利用RNAi下調(diào)豬STING的表達(dá)則抑制RNA病毒和DNA病毒在細(xì)胞中所誘導(dǎo)的IFN-β的

9、表達(dá)。這些結(jié)果提示STING是豬天然免疫系統(tǒng)中的一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子,為進(jìn)一步闡明STING在天然免疫中的作用提供了依據(jù)。
　　 3.PRV誘導(dǎo)β干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究偽狂犬病毒(PRV)屬于皰疹病毒科,為雙鏈DNA病毒。以前的研究表明,PRV感染能有效誘導(dǎo)機(jī)體天然免疫。但是迄今為止對(duì)于PRV是否誘導(dǎo)β干擾素(IFN—β)的產(chǎn)生及其分子機(jī)制還不清楚。采用IFN-β啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PRV感染PK-15細(xì)胞(porci

10、ne kidney cell line)后能顯著誘導(dǎo)IFN-β的產(chǎn)生,熒光定量RT-PCR檢測(cè)也得到了相似的結(jié)果。為了闡明PRV感染PK-15細(xì)胞激活I(lǐng)FN-β的分子機(jī)制,運(yùn)用RNAi技術(shù)和顯性負(fù)調(diào)控突變體分別研究了胞內(nèi)信號(hào)通路和TLR信號(hào)通路在PRV激活I(lǐng)FN-β中的作用。結(jié)果顯示PRV可通過TLR(Toll-like receptor)的接頭分子MyD88(myeloid differentiation factor-88)和胞內(nèi)信

11、號(hào)分子RIG-Ⅰ(retinoic acid-induciblegeneⅠ)和VISA(virus—induced signaling adaptor)激活I(lǐng)FN-β。有趣的是,RNAi實(shí)驗(yàn)表明PRV感染PK-15細(xì)胞誘導(dǎo)IFN-β的表達(dá)需要IRF1(interferon regulatory factor1)、IRF5(interferon regulatory factor5)和IRF7(interferon regulatory

12、factor7)參與,卻不需要IRF3。IRF3是干擾素調(diào)節(jié)因子(imerferon regulatory factors,IREs)家族中的重要轉(zhuǎn)錄因子之一,并且在很多病毒誘導(dǎo)的干擾素基因表達(dá)和抗病毒天然免疫反應(yīng)中都具有重要作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證IRFs與PRV感染激活I(lǐng)FN-β產(chǎn)生的關(guān)系,將各個(gè)干擾素調(diào)節(jié)因子的負(fù)調(diào)控突變體轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞系(human embryonic kidney cell line,HEK293),然后用PRV

13、感染,結(jié)果證明PRV感染HEK293細(xì)胞激活I(lǐng)FN-β產(chǎn)生也不需要轉(zhuǎn)錄因子IRF3的參與。這些結(jié)果提示PRV通過一種獨(dú)特的機(jī)制調(diào)節(jié)天然免疫。但是,很多問題仍然未知,如PRV如何被信號(hào)分子識(shí)別以及具體的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)等。對(duì)這些問題的研究將有助于進(jìn)一步了解DNA病毒誘導(dǎo)的天然免疫機(jī)制。
　　 4.TGEV誘導(dǎo)β干擾素產(chǎn)生的分子機(jī)制研究豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬,為不分節(jié)段的單股.鏈RNA病毒。以前的研究表明

14、,TGEV誘導(dǎo)IFN-Ⅰ的表達(dá)。但是對(duì)其誘導(dǎo)IFN-Ⅰ產(chǎn)生的機(jī)制并不清楚。我們利用熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)和熒光定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TGEV在PK-15細(xì)胞中能顯著激活I(lǐng)FN-β。進(jìn)一步對(duì)TLR信號(hào)通路和胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)分子在TGEV誘導(dǎo)IFN-β中的作用的研究發(fā)現(xiàn),TGEV可通過TLR信號(hào)通路的接:分子MyD88誘導(dǎo)IFN-β,同時(shí)還依賴RIG-Ⅰ、MDA5(melanomadifferentiation-associated gene5)、ST

15、ING、HMGB1(High mobility group box1)、HMGB2(High mobility group box2)、IRF5和IRF7等胞內(nèi)信號(hào)分子,但與TRIF(TIRdomain-containing adaptor inducing IFN-β)、IRF1及IRF3無關(guān)。對(duì)TGEV各結(jié)構(gòu)蛋白誘導(dǎo)豬IFN-β啟動(dòng)子能力的研究發(fā)現(xiàn),M蛋白(membrane protein)和N蛋白(nucleocapsidprot