Survivin和CyclinD1在胃癌細(xì)胞株SGC7901-ADR 多藥耐藥的相關(guān)性研究.pdf

1、研究背景：
　　胃癌作為人類最常見的消化道惡性腫瘤之一，在我國呈現(xiàn)低早期診斷率，高死亡率的特點?；焺t是中晚期胃癌和胃癌術(shù)后的主要治療手段之一，但是腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的產(chǎn)生嚴(yán)重影響化療療效。腫瘤的多藥耐藥是很多因素共同作用的結(jié)果，其作用機制復(fù)雜，至今尚未明確。深入研究胃癌的多藥耐藥產(chǎn)生機制，實現(xiàn)耐藥性的逆轉(zhuǎn)，將會給胃癌的臨床治療帶來新的突破。
　　生存素（survivin）和細(xì)胞

2、周期蛋白D1（cyclinD1）在諸多腫瘤中都具有高表達(dá)特性，但在胃癌耐阿霉素細(xì)胞株SGC7901/ADR中未見明確研究。本課題組研究發(fā)現(xiàn) Wnt/β-catenin信號通路中的β-catenin（β連環(huán)蛋白）在胃癌耐阿霉素藥細(xì)胞株SGC7901/ADR中表達(dá)明顯高于SGC7901細(xì)胞株，β-catenin可能參與胃癌MDR的過程。在S100A6基因下調(diào)的SGC7901質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)β-catenin也呈現(xiàn)低表達(dá)，β-cateni

3、n和 S100A6兩者存在正相關(guān)性，均與耐藥有關(guān)。Survivin和cyclinD1均作為Wnt/β-catenin下游具有爭議的因子，在腫瘤多藥耐藥中的作用尚不明確，在胃癌及其耐阿霉素細(xì)胞中尚未有報導(dǎo)。
　　本研究采用Western Blotting（蛋白免疫印跡）、ICC（免疫細(xì)胞化學(xué)）、RT-PCR和CCK8（細(xì)胞增殖與活性檢測）實驗技術(shù)來檢測survivin和cyclinD1在人胃癌細(xì)胞SGC7901及其耐藥細(xì)胞SGC79

4、01/ADR和本課題組之前所構(gòu)建的S100A6下調(diào)SCG7901細(xì)胞所導(dǎo)致β-catenin呈低表達(dá)的shRNA-1、shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的表達(dá)情況，探討Wnt/β-catenin、survivin和cyclinD1三者之間是否存在關(guān)系，與胃癌耐藥之間所存在的關(guān)系。為 Wnt/β-catenin通路作為臨床治療以及克服胃癌的多藥耐藥提供相關(guān)理論依據(jù)。
　　目的：
　　探討survivin、cyclinD1與SGC79

5、01/ADR細(xì)胞株中的多藥耐藥的關(guān)系，并進(jìn)一步探討survivin、cyclinD1與Wnt/β-catenin參與胃癌MDR的過程。
　　方法：
　　1、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(ICC)、Western Blotting(WB)技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測survivin、cyclinD1在人胃癌SGC7901細(xì)胞及其耐阿霉素細(xì)胞SGC7901/ADR中的差異；2、ICC技術(shù)、WB技術(shù)和RT-PCR技術(shù)檢測survivin、cyc

6、linD1分別在SGC7901細(xì)胞中S100A6下調(diào)導(dǎo)致β-catenin低表達(dá)的shRNA-1、shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞中的表達(dá)差異。3、CCK-8細(xì)胞毒性實驗檢測上述五種細(xì)胞的半抑制濃度(IC50)和耐藥指數(shù)（RI）。
　　結(jié)果：
　　1、Survivin結(jié)果顯示：（1）ICC：survivin在SGC7901細(xì)胞漿深染成棕褐色，染色呈強陽性（+++）；SGC7901/ADR細(xì)胞漿和部分細(xì)胞核深染成棕褐色，染色呈強陽性

7、（+++）；SGC7901、NC質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞為棕褐色，染色呈強陽性（+++），β-catenin低表達(dá)的shRNA-1、shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色，染色呈陽性（++）。（2）Western blotting顯示survivin蛋白在SGC7901/ADR細(xì)胞中平均表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞，差異性顯著，p值＜0.05；SGC7901細(xì)胞中平均表達(dá)量明顯高于β-catenin低表達(dá)的S100A6下調(diào)株shRNA-1和

8、shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞，差異性顯著，p值＜0.05。（3）RT-PCR結(jié)果顯示：survivin在SGC7901/ADR細(xì)胞中的平均表達(dá)量高于SGC7901細(xì)胞，差異性顯著，p值＜0.05。Survivin在 SGC7901細(xì)胞中平均表達(dá)量明顯高于β-catenin低表達(dá)的S100A6下調(diào)株 shRNA-1和shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的表達(dá)量，p值<0.05，有顯著性差異。2、CyclinD1結(jié)果顯示（1）ICC：cyclinD1在

9、SGC7901部分細(xì)胞核深染成棕黃色，染色呈陽性（++），SGC7901/ADR細(xì)胞核深染成棕褐色，染色呈強陽性（+++）； SGC7901和NC質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞胞漿染色呈棕黃色，染色呈陽性（++）；β-catenin低表達(dá)的shRNA-1和 shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞胞漿無染色，染色呈陰性（—）。（2）Western blotting：cyclinD1顯示SGC7901/ADR細(xì)胞中的平均表達(dá)量明顯高于SGC7901細(xì)胞，差異性顯著（p＜

10、0.05）；SGC7901細(xì)胞中平均表達(dá)量明顯高于β-catenin低表達(dá)的S100A6下調(diào)株 shRNA-1和 shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的表達(dá)量，p<0.05，差異性顯著。（3） RT-PCR結(jié)果顯示：cyclinD1在SGC7901/ADR高于SGC7901細(xì)胞差異性顯著（p＜0.05）；SGC7901細(xì)胞中 mRNA平均表達(dá)量明顯高于S100A6下調(diào)至β-catenin低表達(dá)的shRNA-1和shRNA-3質(zhì)粒穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的表達(dá)量，

11、p值<0.05，具有顯著差異。
　　結(jié)論：
　　1、Survivin和 cyclinD1參與人胃癌耐藥細(xì)胞株SGC7901/ADR耐藥，survivin、cyclinD1高表達(dá)，細(xì)胞的耐藥性增加。
　　2、2、Survivin和 cyclinD1位于Wnt/β-catenin信號通路下游，參與胃癌的多藥耐藥。
　　3、3、β-catenin高表達(dá)，survivin和cyclinD1表達(dá)均增高；β-catenin低