海月水母響應環(huán)境低氧的分子機制研究.pdf

1、河口、海灣及近岸海域出現(xiàn)的低氧區(qū)和海洋中大型膠質類水母的暴發(fā)嚴重威脅到漁業(yè)資源和海洋生態(tài)系統(tǒng)的健康。相對于其他海洋生物,水母類能夠耐受低氧并且頻繁出現(xiàn)在低氧水域,但是對此現(xiàn)象的機制性研究并不多見,尤其未見有關水母耐受低氧分子調控機制研究的報道。顯然,要了解環(huán)境低氧與水母暴發(fā)的相互關系,就必須對水母類響應環(huán)境低氧的機制進行深入研究。
　　針對水母類耐受低氧并且頻繁出現(xiàn)在低氧水域的現(xiàn)象,本文以我國近海大型水母—海月水母為研究對象,通過

2、構建低氧培養(yǎng)控制體系,以低氧誘導因子(Hypoxia Inducible Factor, HIF)為中心,對低氧環(huán)境下海月水母生理活性、有關基因表達和代謝產物的含量進行測定、比較和分析,以期揭示水母響應低氧的分子機制。研究獲得的主要結果如下:
　　1、證實了海月水母細胞內存在低氧誘導因子基因
　　根據(jù)海月水母轉錄組測序獲得了低氧誘導因子(HIF-1α)部分基因序列,通過RT-PCR和RACE技術獲得HIF-1α基因2,466

3、 bp的全長cDNA,共編碼675個氨基酸。對蛋白質功能結構域分析表明,海月水母HIF-1α含有bHLH、PAS、NODD、CODD和CTAD五個保守的功能結構域。以HIF-1α全長cDNA序列為基礎,通過克隆、測序、拼接得到10,739 bp的基因序列。通過與其他模式生物HIF-1α蛋白功能結構域和基因結構的比較發(fā)現(xiàn),海月水母HIF-1α具有與高等動物類似的完整的氧依賴降解調控結構域(NODD、CODD和 CTAD),然而結構域的組織

4、形式和基因結構卻更傾向于低等動物。
　　2、在海月水母體內檢測到HIF-1α蛋白的存在并證實該蛋白受環(huán)境低氧的誘導表達
　　利用重組蛋白的體外表達技術成功獲得約為75 kDa的海月水母HIF-1α蛋白片段(融合蛋白),并通過免疫得到針對該蛋白片段的高效價特異性多克隆抗體。利用純化的多克隆抗體,通過免疫印跡技術在海月水母體內檢測到HIF-1α蛋白的存在并證實該蛋白受環(huán)境低氧的誘導表達。
　　3、確定了用于低氧相關基因表達

5、分析的內參基因
　　通過對刺胞動物門肌動蛋白(actin)保守序列的分析,設計并合成其 actin基因的簡并引物。以海月水母cDNA為模板,通過克隆測序獲得849 bp的β-actin基因的部分 cDNA序列。利用實時熒光定量 PCR技術對海月水母18S rRNA、β-actin、α-tubulin和GAPDH四個候選基因在正常(對照組)和低氧條件下的表達量進行檢測,通過內參基因篩選軟件對它們進行分析篩選,最終確定α-tubuli

6、n基因作為海月水母耐受低氧分子機制研究的內參基因。以此為基礎,建立了低氧耐受過程相關基因相對表達量分析的實時熒光定量PCR檢測方法(RFQ-PCR)。
　　4、研究了海月水母在低氧環(huán)境條件下的生理活性(傘部搏動)、脯氨酸羥基化酶-低氧誘導因子氧感受體系相關基因(PHD和 HIF-1α)、能量代謝相關基因(ALDO、LDH和PDK)和HSP70基因的表達以及能量代謝產物(乳酸)含量隨時間的變化規(guī)律,發(fā)現(xiàn):
　　(1)在0.5

7、mg/L的低氧條件下,海月水母明顯受到環(huán)境低氧的脅迫,進而表現(xiàn)出明顯的低氧適應性,適應周期大約為30小時。由于培養(yǎng)體系中氧氣的缺乏,海月水母的生理活性受到抑制,表現(xiàn)為海月水母傘部搏動的降低和 HSP70基因相對表達量的急劇增加,但經過大約30個小時的機制轉換和調節(jié),會逐漸恢復到正常狀態(tài)。(2)在海月水母適應低氧的過程中,脯氨酸羥基化酶-低氧誘導因子氧感受體系相關基因和物質能量代謝相關基因的相對表達量都在18小時出現(xiàn)峰值,說明此時海月水母

8、在分子水平上響應低氧誘導和進行能量代謝機制的轉換與調節(jié)最為活躍。(3)脯氨酸羥基化酶-低氧誘導因子氧感受體系在海月水母耐受并響應環(huán)境低氧的過程中起重要作用。對照組中HIF-1α和PHD基因的相對表達量較為穩(wěn)定,而在低氧組中兩者均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢,說明在分子水平上,海月水母細胞通過快速上調 HIF-1α基因的轉錄而快速合成 HIF-1α蛋白,該蛋白迅速結合到PHD基因的增強子區(qū)域,誘導PHD基因的轉錄。(4)低氧條件下,海月水母細

9、胞內存在依賴于乳酸脫氫酶的無氧代謝過程。LDH基因的相對表達量和乳酸的含量隨著低氧培養(yǎng)時間的延長逐漸升高,說明乳酸脫氫酶催化的可逆反應正在向乳酸方向進行。
　　5、提出海月水母耐受并適應低氧環(huán)境的分子機制是脯氨酸羥基化酶-低氧誘導因子氧感受體系調控下的有氧代謝向無氧代謝的轉換
　　在低氧條件下,轉錄因子HIF-1α受低氧誘導表達并迅速結合到糖酵解各個關鍵酶基因(如ALDO和PDK)的增強子區(qū)域,誘導靶基因的增強表達,通過加速

10、糖酵解提供的能量來維持海月水母的生理功能。轉錄因子HIF-1α進一步通過誘導 LDH基因的表達將在細胞內由于糖酵解加速而累積的丙酮酸轉化為乳酸,最終實現(xiàn)有氧代謝向無氧代謝的轉換。
　　6、提出低氧條件下海月水母轉錄因子HIF蛋白的大量表達可能是轉錄水平和翻譯后水平共同作用的結果
　　直接證實了HIF-1α在海月水母中存在轉錄水平上的調控。而對HIF-1α進行蛋白質功能結構域的分析則發(fā)現(xiàn),海月水母HIF-1α含有氧依賴降解區(qū)(