薇甘菊對田野菟絲子寄生響應(yīng)的生理生化和分子機(jī)制研究.pdf

1、薇甘菊是菊科的一種藤本植物，被列為世界上最具入侵力的100種外來物種之一。近二十年來，薇甘菊入侵華南地區(qū)，并對華南地區(qū)的生態(tài)系統(tǒng)造成嚴(yán)重的破壞。近年來，在華南地區(qū)，用野菟絲子寄生對薇甘菊的生物量積累，生理和生態(tài)方面的影響效應(yīng)研究表明，田野菟絲子可作為一種控制薇甘菊的有效的方法。為了研究田野菟絲子寄生對薇甘菊的生理生化和基因表達(dá)的影響機(jī)理，本論文對此問題進(jìn)行了初步探討。結(jié)果如下： (一)溫室盆栽實驗研究表明： (1)在田野

2、菟絲子寄生薇甘菊的9-18天內(nèi)，過氧化氫酶(CAT)活性極顯著(p<0.01)高于對照，隨后在27-36天內(nèi)，降至對照水平；在田野菟絲子寄生薇甘菊的9-18天內(nèi)，過氧化物酶(POD)活性顯著(p<0.05)高于對照，但在27-36天時，降至對照水平甚至還低于對照；在田野菟絲子寄生薇甘菊的9-27天內(nèi)，抗壞血酸氧化酶(APX)活性極顯著(p<0.01)高于對照，但在36天時，降至對照水平；在田野菟絲子寄生薇甘菊的9-36天內(nèi)，超氧化物歧化

3、酶(SOD)活性均顯著(p<0.05)高于對照。 (2)在田野菟絲子寄生薇甘菊的9-36天內(nèi)，薇甘菊葉片中MDA含量隨寄生時間的延長增多，并且極顯著(p<0.01)。 (3)田野菟絲子寄生能促進(jìn)薇甘菊葉中可溶性糖的積累，減少薇甘菊葉片中可溶性蛋白含量。田野菟絲子寄生使薇甘菊葉中的總?cè)~綠素、葉綠素a、葉綠素b含量顯著下降，并且隨著寄生時間的延長，下降更為明顯。隨著田野菟絲子寄生時間的延長，極顯著的抑制了Rubisco羧化酶

4、和GO酶的活性。 (4)田野菟絲子在寄生薇甘菊的36天內(nèi)，薇甘菊葉的凈光合速率(Pn)，氣孔導(dǎo)度(Gs)，蒸騰速率(Tr)和瞬時水分利用效率(WUE)都比對照降低，在36天時，薇甘菊葉的Pn，Gs和WUE都極顯著降低。 (5)透射電鏡表明，田野菟絲子寄生18天后的薇甘菊葉片的葉綠體形狀異常；葉綠體腫脹變圓：葉綠體中嗜鋨顆粒變多變大，淀粉粒的積累比對照明顯增多而且體積增大；病變的葉綠體呈現(xiàn)小空泡；嚴(yán)重的導(dǎo)致葉綠體從細(xì)胞膜脫

5、落，葉綠體膜破裂和葉綠體解體。 (二)構(gòu)建了兩個正向削減文庫，共篩選到303個薇甘菊的EST。這些EST編碼各種不同功能的蛋白，如新陳代謝、細(xì)胞防御與脅迫反應(yīng)、轉(zhuǎn)錄因子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運(yùn)輸和光合作用，其中一些基因也與其它報道的寄主植物的表達(dá)上升的基因有同源性。在薇甘菊的頂芽和莖中，均發(fā)現(xiàn)一些與細(xì)胞防御和細(xì)胞壁修復(fù)相關(guān)的基因，但是頂芽和莖中的基因表達(dá)模式是不同的。此外，薇甘菊頂芽中16.29％的ESTs和薇甘菊莖中17.60％的EST

6、在NCBI數(shù)據(jù)庫中匹配到未知功能。另外，相對定量PCR檢測了21個隨機(jī)選取的ESTs在寄生的薇甘菊中的表達(dá)水平，與對照相比，其中13個基因的表達(dá)量顯著上升。這些結(jié)果表明，薇甘菊對田野菟絲子寄生的分子響應(yīng)是一個相當(dāng)復(fù)雜的過程。同時可看出，SSH文庫測序結(jié)合定量PCR可以成功的用來檢測田野菟絲子寄生誘導(dǎo)的薇甘菊基因?？傊?，本實驗構(gòu)建的削減文庫所獲得的相關(guān)基因，提供了田野菟絲子寄生對薇甘菊基因表達(dá)影響的總的響應(yīng)情況，同時這些基因片段為以后深入

7、研究薇甘菊與田野菟絲子的相互作用打下了較好的基礎(chǔ)。此外，削減文庫中也檢測到75個與植物單鏈RNA病毒基因同源性較高的序列，這些發(fā)現(xiàn)為田野菟絲子與薇甘菊互作提供了新的研究視角，即薇甘菊—田野菟絲子—植物RNA病毒之間復(fù)雜的相互作用關(guān)系。 (三)利用cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)和重疊延伸相結(jié)合的方法，從田野菟絲子寄生的薇甘菊SSH文庫中克隆了一個全長幾丁質(zhì)酶基因的cDNA和兩個NAC基因的cDNAs，并對其進(jìn)行了基因功能方面的初

8、步研究。 (1)根據(jù)薇甘菊頂芽的削減文庫中的一個與幾丁質(zhì)酶基因有很高同源性的基因片段序列，設(shè)計基因特異引物，采用RACE方法克隆了一個全長幾丁質(zhì)酶基因(Mmchil基因)，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。Mmchil基因(GenBank登錄號EU716625)的cDNA全長1295 bp，有957 bp的開放閱讀框，預(yù)測編碼318個氨基酸，有51 bp的5’—UTR(非編碼區(qū))和287 bp的3’—UTR，預(yù)算編碼產(chǎn)物的分子量(Mw

9、)為35.42 kDa，等電點(pI)為5.69。Mmchil基因的DNA序列含有兩個內(nèi)含子，長度分別為1171 bp和621 bp。Southern雜交結(jié)果表明，Mmchil基因在薇甘菊基因組中是一個低拷貝基因家族的成員。RT—PCR分析表明，Mmchil基因在所檢測的組織器官中是特異性表達(dá)的。Mmchil基因在薇甘菊的頂芽中的表達(dá)，受田野菟絲子寄生及其它非生物因子的誘導(dǎo)。此外，我們構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET—32a—Mmchil，將其

10、轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)表達(dá)菌株，通過IPTG誘導(dǎo)，經(jīng)SDS—PAGE分析表明，重組蛋白主要以包涵體形式出現(xiàn)，相對分子量為55 kDa。我們嘗試用不同的表達(dá)載體、降低誘導(dǎo)溫度、調(diào)節(jié)滲透壓和改變表達(dá)的宿主菌等方法。最后，我們將表達(dá)質(zhì)粒pET—32a—Mmchil轉(zhuǎn)入Rasotta—gamiTM(DE3)大腸桿菌菌株，成功地將目的蛋白在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行了表達(dá)，最佳誘導(dǎo)溫度和時間分別是25℃和4 h。目的重組蛋白經(jīng)His—Bind kit試

11、劑盒純化，并且純化的重組蛋白的最佳pH和最佳溫度活性分別為pH5.5-6.5和35-40℃。 (2)從田野菟絲子寄生的薇甘菊的莖的削減文庫中，通過RACE的方法克隆了兩個NAC基因，分別命名為MmATAF1和MmNAP。核酸序列信息表明，MmATAF1和MmNAP基因都含有2個內(nèi)含子和3個外顯子，并且它們的基因組結(jié)構(gòu)都非常保守。這兩個基因的接合位點是通過基因組序列和其對應(yīng)的cDNA序列分析比較得來的。MmATAF1和MmNAP基

12、因編碼的蛋白序列都含有一個引人注目的N末端保守結(jié)構(gòu)域和一個高度多交的C端結(jié)構(gòu)。基于系統(tǒng)進(jìn)化的分析，MmATAF1和MmNAP蛋白分別歸于不同功能的ATAF和NAP亞類。半定量RT—PCR分析表明，MmATAF1和MmNAP基因在檢測的組織里表現(xiàn)不同的表達(dá)模式。MmATAF1基因在所有檢測的組織里都有表達(dá)，但是表達(dá)的豐度不同。MmNAP基因在莖，葉柄，頂芽和葉中都衡量表達(dá)，但在根中不表達(dá)。此外，相對定量PCR分析表明，MmATAF1和Mm

13、NAP基因在薇甘菊的莖中的表達(dá)被田野菟絲子寄生所誘導(dǎo)。另外，MmATAF1和MmNAP基因在薇甘菊的頂芽中的表達(dá)也被機(jī)械損傷，ZnSO4.脫落酸(ABA)和水楊酸(SA)所誘導(dǎo)。將MmATAF1和MmNAP基因與表達(dá)載體pET—32a(+)連接構(gòu)建融合表達(dá)載體，并在E.coli菌株BL21中進(jìn)行了原核表達(dá)，SDS—PAGE分析表明，IPTG誘導(dǎo)產(chǎn)生帶有His標(biāo)簽的融合蛋白His—MmATAF1和His—MmNAP的分子量(Mr)分別約為

14、49 kDa和52 kDa。 本論文的田野菟絲子寄生對薇甘菊的生理生化的影響、田野菟絲子寄生薇甘菊誘導(dǎo)的SSH文庫的構(gòu)建、克隆cDNA全長及其基因功能方面的研究取得了初步結(jié)果，發(fā)現(xiàn)了大量的薇甘菊基因，為進(jìn)一步研究其基因結(jié)構(gòu)和時空表達(dá)特性及其生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。本論文的創(chuàng)新點為：(1)首次在國際上研究了薇甘菊的頂芽和莖中差異表達(dá)的基因?qū)μ镆拜私z子寄生早期的分子響應(yīng)機(jī)制。(2)首次發(fā)現(xiàn)了MmATAF1和MmNAP基因被田野菟絲子寄