出生至斷奶仔豬胃腸道FcRn表達規(guī)律及其與IgG轉(zhuǎn)運關(guān)系的研究.pdf

1、仔豬成活率一直是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一，而母乳的免疫球蛋白水平及其向仔豬的轉(zhuǎn)運對仔豬早期存活至關(guān)重要。剛出生的仔豬體內(nèi)抗體基本為零，新生仔豬的免疫主要來自初乳中的母源抗體提供的被動免疫。IgG是家畜初乳中含量最豐富的免疫球蛋白成分，IgG由乳腺向乳汁中的分泌以及新生動物對乳中母源IgG的攝取均需要穿越上皮細胞屏障，即進行細胞轉(zhuǎn)運作用，這一過程是由受體介導(dǎo)的，而特異性轉(zhuǎn)運IgG的唯一受體是新生兒Fc受體(neonatal Fc re

2、ceptor，F(xiàn)cRn)。 研究表明，F(xiàn)cRn具有獨特的重要功能，它不僅在IgG從母體劍仔畜的轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著極其重要的作用，而且在成年動物體內(nèi)終生表達，維持血液IgG和清蛋白水平的相對平衡和穩(wěn)定，F(xiàn)cRn還與動物的生長發(fā)育和免疫應(yīng)答密切相關(guān)。對該受體的研究可以揭示機體免疫球蛋白的轉(zhuǎn)運機制，從而對臨床應(yīng)用和生產(chǎn)實踐具有重要的理論指導(dǎo)價值。 本研究以大白和長白二元雜交仔豬作為研究對象，分別采集從出生當天至斷奶后共12個日齡仔豬

3、血液和肝、腎、脾、心臟、胃以及腸道各段組織，進行了如下方面的試驗。 1.應(yīng)用RT-PCR方法研究了FcRn在仔豬體內(nèi)不同組織的表達分布及不同日齡仔豬胃腸道FcRn的表達變化。結(jié)果表明，F(xiàn)cRn在仔豬肝、腎、脾、心臟以及胃腸道各段組織中均有表達。經(jīng)對FcRn/GAPDH電泳條帶密度掃描分析，仔豬胃腸道中以十二指腸后段和空腸前段表達量最高，在十二指腸和空腸段，從一出生就有較高水平的FcRn轉(zhuǎn)錄，吮乳后至出生后1d達劍峰值，4d后Fc

4、RnmRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯降低(P<0.05)，至斷奶時降劍最低?；啬c段FcRn表達水平較十二指腸和空腸段低，表達量變化不明顯。胃與結(jié)腸部位FcRn的表達最低，且不同日齡問表達比較穩(wěn)定。FcRn在仔豬十二指腸后段和空腸前段的高表達水平提示仔豬十二指腸、卒腸是FcRn轉(zhuǎn)運初乳中IgG的主要部位。 2.應(yīng)用實時熒光定量PCR方法，對仔豬肝臟和胃腸道組織中FcRn的表達進行了定量檢測。根據(jù)GenBank公布的豬FcRn重鏈mRNA基因保

5、守序列臼行設(shè)計PCR引物和熒光探針，并以B-actin為管家基因，建立測定仔豬FcRn mRNA表達的實時熒光定量PCR方法。檢測結(jié)果表明，F(xiàn)cRn在仔豬體內(nèi)不同組織中表達水平有顯著差異。其中，在肝臟中表達水平最高(ΔCt=4.95)；其次是在十二指腸遠端和空腸近端；十二指腸近端和空腸遠端的表達量次之；在仔豬同腸和結(jié)腸部位均為低表達，且表達量極為接近：FcRn在仔豬胃內(nèi)也有表達，但表達量最低(ΔCt=6.91)。FcRn mRNA表達量

6、隨日齡的變化規(guī)律為：出生當天表達水平較低，未吃初乳(0w)和已吃初乳(Oy)沒有顯著差異(P>0.05)；1d時表達水平顯著升高(P<0.05)，隨后維持在較穩(wěn)定的水平直至21d時有所下降；28d時FcRn在胃腸道各部位表達均有顯著升高(P<0.05)；35d時則普遍回落到與前期相近的水平。 3.建立了檢測仔豬小腸FeRn表達的地高辛標記探針原位雜交方法。根據(jù)GenBank公布的豬FcRn重鏈(α鏈)mRNA基因保守序列設(shè)計并合

7、成帶地高辛標記的原位雜交試驗用cDNA探針。經(jīng)仔豬小腸冰凍組織切片最佳厚度選擇，以及H2O2溶液祛除小腸組織中內(nèi)源性辣根過氧化物酶作用對雜交結(jié)果的影響，選擇合適的固定劑、細胞膜蛋白消化劑、雜交液和確定雜交反應(yīng)的溫度、時間以及雜交后處理等一系列試驗條件優(yōu)化，建立了檢測仔豬小腸FcRn mRNA的原位雜交方法。結(jié)果顯示，原位雜交的最佳反應(yīng)條件為：冰凍組織切片厚度為14 μm；固定液采用4％多聚甲醛溶液，固定時間為1h；雜交前用1％的Trit

8、on X-100處理切片15 min采用含有50％去離子甲酰胺的Yeast RNA雜交液，每張切片滴加30μL～50μL；探針濃度為1.5 μg/mL雜交溫度為46.8℃，時間為18h；與辣根過氧化物酶標記的抗地高辛抗體(anti-DIG-HRP)于4℃作用16h后，用DAB顯色10～15 min；切片最后用蘇木素染色液復(fù)染。 4.應(yīng)用原位雜交方法研究了FcRn mPNA在仔豬小腸各段的表達分布特點，并利用相應(yīng)軟件進行了表達量分

9、析。結(jié)果表明，在仔豬十二指腸、空腸和同腸組織的小腸上皮細胞和黏膜下層等部位均檢測到清晰的雜交信號。其中，在小腸黏膜上皮檢測到大量的FcRn mRNA陽性信號，尤其是空腸部位表達信號最強，其次是十二指腸遠端，而在十二指腸近端和同腸段表達信號相對較弱；而小腸黏膜固有層的陽性信號主要集中在固有層內(nèi)小血管周圍，且以空腸部位為主；在十二指腸、空腸和同腸部位的黏膜下層均檢測到FcRn mRNA陽性信號，其中在空腸黏膜卜層表達最強。仔豬FcRn的表達

10、動態(tài)為：出生3d內(nèi)FcRn在仔豬十二指腸、空腸和回腸部位均為高表達，3d時出現(xiàn)顯著下降，隨后表達水平基本穩(wěn)定，直至21d后才出現(xiàn)回升。其中，十二指腸部位從仔豬一出生即高表達FcRn，而同腸部位FcRn的表達從3d開始直至斷奶后一直維持在低水甲。 5.進行了仔豬血清IgG水平動態(tài)的檢測，并分析了與小腸FcRn表達的相關(guān)性。利用放射免疫測定(RIA)檢測了從初生劍斷奶階段仔豬血液免疫球蛋白IgG的水平及其變化動態(tài)。結(jié)果表明，在山生后

11、2d內(nèi)仔豬血液IgG抗體水平的變化與小腸FcRn表達量具有高度相關(guān)性，提示FcRn在新生仔豬腸道轉(zhuǎn)運IgG過程中的主要作用。其中在仔豬剛出生時IgG含量為0，吸吮初乳后(0.5d)水平迅速上升，至1d時達到峰值，而在3d時IgG水平山現(xiàn)急劇下降，IgG水平在7d時達劍第2次高峰，但從10d顯著卜降隨后基本保持穩(wěn)定，至35d時血液IgG水平又出現(xiàn)大幅度升高，達到4.74.mg/mL。 對仔豬FcRn表達的定性、定位和定量檢測均表明