BMI指數(shù)與大鼠ALI模型的肺損傷程度相關性研究.pdf

1、目的：
　　了解不同級別肺損傷動物模型肺組織病理學評分及W/D差異；了解不同級別肺損傷動物模型外周血炎癥因子TNF-α、IL-1β水平表達變化及其差異基本規(guī)律；了解不同級別肺損傷動物模型外肺組織中NF-κBp65 mRNA水平，NF-κB p65核轉位比率三指標共同評價BMI導致表達的差異規(guī)律；通過W/D、肺損傷病理評分、TNF-α、IL-1β、NF-κBp65五個指標聯(lián)合評價肺損傷程度，并將BMI指數(shù)與肺損傷程度作相關性分析，期

2、望證實BMI指數(shù)是發(fā)生ALI的獨立危險因子；通過分析不同BMI指數(shù)組Angptl2 mRNA與蛋白水平，從Angptl2是肥胖的關鍵性脂源性炎癥因子角度出發(fā)，探討B(tài)MI與ALI相關性的可能機制通路。
　　方法：
　　健康雄性SD大鼠36只，體質量(168±31)g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，按完全隨機原則分為4組(n=9)，C組(空白對照組)、OA組(普通大鼠OA造模組)采用普通飼料喂養(yǎng)，C-H組(高脂肥胖對照組)、O

3、-H組(高脂肥胖油酸造模組)采用高脂飼料(20％豬油，10％奶粉，10％雞蛋，60％普通飼料)誘導肥胖模型。8周后測量體重指數(shù)BMI(Kg/m2)及血脂水平(mmol/L)。C組、C-H組采用尾靜脈注射生理鹽水作對照組，OA、O-H兩組采用尾靜脈注射油酸復制肺損傷模型，各組劑量均為0.1ml/kg，造模后4h通過觀察造模后大鼠的呼吸頻率、皮膚粘膜顏色、活動行為初步判斷造模成功與否，采用3.5％水合氯醛充分麻醉大鼠(10ml/kg)，頸靜

4、脈取血分離血漿備用；開胸后肉眼觀察肺組織出血、水腫情況取右肺固定部分作濕重/干重比值(W/D)、肺組織冰凍切片及病理學觀察，取左肺組織分裝凍存于負80℃冰箱備用，作肺組織炎癥因子含量TNF-α、IL-1β及免疫熒光檢測NF-κBp65核轉位比率、半定量PCR法檢測肺組織NF-κB mRNA表達水平：Real time quantitative-PCR法定量檢測肺組織Angptl2 mRNA表達水平，Western blot半定量檢測肺組

5、織Angptl2蛋白表達。
　　結果：
　　1.大鼠呼吸頻率、皮膚粘膜、活動行為C組及C-H組大鼠一般情況好，精神狀態(tài)可，呼吸平穩(wěn)，頻率分別為(44±12)、(42±8)次/分，無紫紺出現(xiàn)，未見死亡。OA組大鼠于造模后1～4h呼吸頻率顯著增加，達(98±13)次/分，全身毛發(fā)豎立，紫紺出現(xiàn)，未見死亡。O-H組大鼠造模后數(shù)分鐘呼吸頻率顯著增加(130±22)次/分，全身毛發(fā)豎立肺部哮鳴音顯著，口唇紫紺較OA組更為明顯，4h內死

6、亡一只。分別測得4組大鼠血脂、體重、身長，C組、OA組甘油三酯(TG)、BMI兩指標差異沒有統(tǒng)計學意義，C-H、O-H組TG及BMI指數(shù)較前兩組顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)
　　2.肺組織濕/干重、肺組織形態(tài)學觀察開胸后觀察肉眼下，C組肺組織表面光滑，淺粉紅色，無充血、水腫，C-H組可見肺組織較正常組肥大，表面可見黃色脂肪組織；OA模型組肺組織呈暗紅色，可見廣泛點狀或灶狀出血，病理可見肺水腫、肺出血、炎細胞浸潤等肺

7、損傷典型改變：O-H組肺組織明顯增大成暗紅色，部分部位略成黃白色，大片灶狀區(qū)域，病理可見明顯水腫，大量炎細胞浸潤。參照文獻對4組大鼠肺損傷病理學評分結果示，C-H組、O-H組及OA組均較C組升高差異具有統(tǒng)計學意義，且O-H組與OA組相比差異同樣具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，但從W/D數(shù)據顯示O-H與OA兩組差異并無統(tǒng)計學意義(P>0.05)
　　3.各組血漿TNF-α、IL-1β含量差異肺組織勻漿上清液TNF-α、IL-1β的測

8、定可評估肺組織炎癥反應程度。在造模后4hOA、O-H兩組TNF-αI、L-1β較對照組均明顯升高，且O-H組較OA升高更為明顯。
　　4.免疫熒光檢測NF-κB p65核轉位比率圓形綠色熒光代表NF-κBp65蛋白所在的陽性細胞圖像，熒光標記主要濃集胞核區(qū)。C組陽性細胞少，OA模型組核轉位陽性細胞增多，O-H組較OA組升高更為明顯(見圖2)。用ImageJ軟件測定每組圖片光密度值，O-H模型組光密度值高于OA組，差異有統(tǒng)計學意義(

9、p<0.05)；NF-KB電泳后顯示在348bp處，O-H組NF-KB mRNA表達較OA組顯著增加(p<0.05)。
　　5.PCR半定量測定肺組織NF-κB p65 mRNA表達量PCR結果顯示，C組NF-κB p65 mRNA灰度值最低，OA模型組NF-κBp65 mRNA灰度值增加，兩組之間差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05)；O-H組較C-H組灰度值明顯增加，差異同樣具有統(tǒng)計學意義(p<0.05))；同時O-H較OA組升高

10、更為明顯(p<0.05)。
　　6.BMI指數(shù)分別與肺組織W/D、病理評分、血漿炎癥因子INF-α、IL-1β相關性分析BMI指數(shù)與上述指標均成正相關，與病理評分及IL-1β相關性最高，與W/D相關性不明顯。未造模組：BMI與W/D：0.62、病理評分：0.78、TNF-α：0.83、IL-1β：0.84；造模組：BMI與W/D：0.29、病理評分：0.85、TNF-α：0.65、IL-1β：0.79。
　　7.Real t

11、ime quantitative-PCR法定量檢測肺組織Angptl2 mRNA表達水平，Western blot法半定量檢測肺組織Angptl2 mRNA表達水平Angptl2在肺組織中呈陽性表達，油酸造模后，OH組與CO組呈明顯升高狀態(tài)，差異具有統(tǒng)一學意義。
　　8.免疫組化分析免疫組化結果顯示：該蛋白主要集中在肺泡壁外側或內側，相同BMI水平，肺損傷組的Angptl2表達量增加，不同BMI水平，Angptl2在高BMI組即肺

12、損傷程度嚴重組表達量增加；將OA組與O-H組相對比發(fā)現(xiàn)，在Angptl2的表達量越多的部位，肺泡壁塌陷程度越重、水腫液滲出越多，該蛋白在肺損傷程度重的組別表達更為廣泛、表達量更高，這一結果與RT-PCR、Western Blot結果相一致。
　　結論：
　　1)BMI的升高可導致肺損傷模型病理學評分、大鼠外周血炎癥因子TNF-α、IL-1β水平、肺組織中NF-κBp65 m RNA水平升高；
　　2)BMI指數(shù)與肺損傷