缺氧-復(fù)氧誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞釋放的微囊泡對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響.pdf

1、血管內(nèi)皮功能紊亂是多種心血管疾病致病機(jī)制的起始及核心環(huán)節(jié)，是急性心肌梗死，動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的致病基礎(chǔ)。研究表明，糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌缺血等心血管疾病的患者循環(huán)血液中MVs水平上升，這些MVs中包含內(nèi)皮細(xì)胞在受到刺激或凋亡時(shí)所釋放的EMVs。EMVs并非簡(jiǎn)單的生物學(xué)標(biāo)志物，它們同時(shí)在血管內(nèi)皮功能紊亂的致病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。不同病理狀態(tài)下產(chǎn)生的EMVs具有不同的生物學(xué)功能。I/R作為多種心血管疾病的病理生理基礎(chǔ)，可引起血管

2、內(nèi)皮功能紊亂及凋亡壞死。但有關(guān) H/R誘導(dǎo)產(chǎn)生的H/R-EMVs是否在血管內(nèi)皮功能紊亂中發(fā)揮作用以及 H/R-EMVs是否可以削弱離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的內(nèi)皮依賴(lài)性舒張反應(yīng)尚不清晰。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)H/R誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生EMVs，探討H/R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響。
　　目的：
　　研究H/R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張功能的影響及其相關(guān)機(jī)制。
　　方法：
　　1. H/R誘導(dǎo)HUVE

3、Cs損傷模型的建立
　　用含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HUVECs24 h達(dá)到融合70-80%后，棄去培養(yǎng)上清液，換用缺氧液。將HUVECs放置于缺氧裝置中，使用95%N2-5%CO2混合氣，流速20 L/min，充氣15 min以排出缺氧裝置中的空氣。將HUVECs細(xì)胞在缺氧裝置中缺氧培養(yǎng)12 h，繼而復(fù)氧培養(yǎng)4 h。通過(guò)MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，建立H/R誘導(dǎo)HUVECs損傷的模型。
　　2. H/R-EMVs的獲取

4、、流式鑒定及定量檢測(cè)
　　采取梯度離心的方法從細(xì)胞H/R的培養(yǎng)上清液中收集H/R-EMVs，應(yīng)用1μm標(biāo)準(zhǔn)微球和PE-CD144抗體標(biāo)記，流式細(xì)胞儀對(duì)H/R-EMVs進(jìn)行鑒定；采用2μm標(biāo)準(zhǔn)微球?qū)/R-EMVs進(jìn)行計(jì)數(shù)；BCA法對(duì)H/R-EMVs進(jìn)行蛋白定量。
　　3.離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的制備
　　選取Wistar雄性大鼠，體重250±10 g左右，頸脫臼處死，開(kāi)胸，獲取胸主動(dòng)脈。將胸主動(dòng)脈放入盛有4℃ K-H液的培

5、養(yǎng)皿中，用眼科剪小心去除包住胸主動(dòng)脈的筋膜，將動(dòng)脈剪成3-4 mm的胸主動(dòng)脈環(huán)。
　　4.不同濃度H/R-EMVs處理離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)
　　用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(Control)，H/R-EMVs2.5,5,10,20μg/mL組，共5組。H/R-EMVs2.5,5,10,20μg/mL組分別加入2.5,5,10,20μg/mL的H/R-EMVs，Control組加入等

6、體積的D-Hank’s液，孵育4 h。
　　5.不同濃度ACh，SNP介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率的測(cè)定
　　將離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)連接到離體組織灌流裝置，調(diào)整預(yù)負(fù)荷為2g。使用PE10-6 mol/L預(yù)收縮離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)使其收縮達(dá)最大值。15 min后，分別使用10-9-10-6 mol/L的ACh及SNP測(cè)定離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率。
　　6.離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中NO含量的測(cè)定
　　采用Griess Re

7、agent法，測(cè)量離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中NO的含量。
　　7.離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中p-eNOS/t-eNOS的測(cè)定
　　Western blot法檢測(cè)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中p-eNOS/t-eNOS的表達(dá)。
　　8.離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中SOD，MDA含量的測(cè)定
　　SOD，MDA試劑盒測(cè)定離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中SOD，MDA的含量。
　　結(jié)果：
　　1. H/R誘導(dǎo)HUVECs損傷模型的建立
　　在缺

8、氧12 h復(fù)氧4 h處理后，HUVECs出現(xiàn)皺縮和變形，部分細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中。與 Control比較，MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率顯著降低(73.73%±2.61% vs100%±0%，P<0.05)，其降低程度適中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定，適宜采用該模型誘導(dǎo)HUVECs損傷。
　　2. H/R-EMVs的獲取、流式鑒定及定量檢測(cè)
　　低溫超速離心后，可以觀(guān)察到超速離心管底部有肉眼可見(jiàn)的較小面積的白色沉淀，即為H/R-EMVs。流式檢測(cè)證實(shí)

9、誘導(dǎo)得到粒徑<1μm且CD144+的微粒，計(jì)數(shù)結(jié)果為23017±322/μL。H/R-EMVs蛋白濃度為0.35±0.10μg/μL。
　　3. H/R-EMVs對(duì)ACh及SNP介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率的影響
　　與Control組(93.59%±7.53%)比，H/R-EMVs5,10,20組由ACh介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率(81.11%±6.12%,67.71%±5.96%,43.50%±9.35%，P<0.

10、05或P<0.01)顯著降低。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時(shí)劑量依賴(lài)性的降低了ACh介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率；與Control組比，H/R-EMVs2.5組由ACh介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率(99.53%±2.47%)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SNP介導(dǎo)的離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率在各組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4. H/R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中NO含量的影響
　　與Control組(84.64±4.3

11、7μmol)相比，H/R-EMVs5,10,20μg/mL組NO含量(72.61±0.81,34.58±1.97,21.45±1.16μmol，P<0.01)顯著降低。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時(shí)劑量依賴(lài)性的降低了離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中NO的含量。與Control組相比，H/R-EMVs2.5組NO含量(88.26±4.68μmol)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　5. H/R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中p-eNOS/t

12、-eNOS表達(dá)的影響
　　Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，隨H/R-EMVs濃度增加，H/R-EMVs5,10μg/mL和H/R-EMVs20μg/mL組p-eNOS蛋白表達(dá)減少，t-eNOS蛋白表達(dá)不變，p-eNOS/t-eNOS比值下降。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時(shí)，劑量依賴(lài)性的降低了離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中 p-eNOS的含量。與 Control組相比，H/R-EMVs2.5μg/m

13、L組離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)p-eNOS蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　6. H/R-EMVs對(duì)離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中SOD活性及MDA含量的影響
　　與 Control組相比(SOD:52.22±1.25 U/mg prot; MDA:1.91±0.11μmol/mg prot)，H/R-EMVs5,10和H/R-EMVs20μg/mL組離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)SOD活性下降(23.44±0.99,17.28±0.63,10.88±0.54

14、 U/mg prot，P<0.01)，MDA含量上升(3.27±0.19,8.08±0.19,10.22±0.17μmol/mg prot，P<0.01)。H/R-EMVs在濃度范圍為5-20μg/mL時(shí)，劑量依賴(lài)性的降低了離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)中SOD的活性并提高了MDA的含量。與Control組比，H/R-EMVs2.5μg/mL組離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)SOD活性(51.48±2.12 U/mg prot)及MDA含量(1.97±0.13μ

15、mol/mg prot)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：
　　1.本實(shí)驗(yàn)成功建立了缺氧12 h復(fù)氧4 h誘導(dǎo)HUVECs損傷的模型。
　　2.采用缺氧12 h復(fù)氧4 h的方法誘導(dǎo)HUVECs產(chǎn)生H/R-EMVs，流式檢測(cè)證實(shí)誘導(dǎo)得到粒徑<1μm且CD144+的H/R-EMVs，其蛋白濃度為0.35±0.1μg/μL。
　　3. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，劑量依賴(lài)性的削弱了離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的舒

16、張率。
　　4. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，劑量依賴(lài)性的降低了離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)的NO含量，NO含量降低導(dǎo)致離體大鼠胸主動(dòng)脈環(huán)舒張率的下降。
　　5. H/R-EMVs的劑量在5-20μg/mL范圍內(nèi)時(shí)，劑量依賴(lài)性的降低了p-eNOS蛋白的表達(dá)，對(duì)t-eNOS的表達(dá)無(wú)影響。提示H/R-EMVs可能通過(guò)下調(diào)p-eNOS的表達(dá)從而減少NO的產(chǎn)生。
　　6. H/R-EMVs誘導(dǎo)了OS反應(yīng)的發(fā)生，H